[发明专利]一种微生物转化制备(R)－3－羟基丁酸乙酯的方法

权利要求书

1.一种微生物转化制备(R)-3-羟基丁酸乙酯的方法，所述方法是以乙酰乙酸乙酯为底物，以膜醭毕赤酵母(Pichia membranaef aciensHansen)细胞为酶源，进行微生物催化不对称还原反应，反应结束后转化液经分离纯化得到所述的(R)-3-羟基丁酸乙酯。

2.如权利要求1所述的微生物转化制备(R)-3-羟基丁酸乙酯的方法，其特征在于所述膜醭毕赤酵母细胞来自：膜醭毕赤酵母经发酵培养获得的发酵液或由发酵液过滤得到的湿菌体。

3.如权利要求1或2所述的微生物转化制备(R)-3-羟基丁酸乙酯的方法，其特征在于：所述底物质量浓度为1～50％，加入发酵产物使湿菌体量为0.3～6g/g底物，所述不对称还原反应的反应温度为20～50℃，反应时间为1～40小时。

4.如权利要求3所述的微生物转化制备(R)-3-羟基丁酸乙酯的方法，其特征在于：反应体系中添加有葡萄糖，添加量为0.1～25g/L。

5.如权利要求4所述的微生物转化制备(R)-3-羟基丁酸乙酯的方法，其特征在于：所述不对称还原反应在0.1M，pH8.0的磷酸缓冲液中进行。

6.如权利要求1所述的微生物转化制备(R)-3-羟基丁酸乙酯的方法，其特征在于所述的发酵产物按如下方法制得：在发酵培养基中接种膜醭毕赤酵母菌种，接种量体积比5～10％，温度20～40℃，培养1～5天后，得发酵液、或将发酵液过滤得所述湿菌体。

7.如权利要求6所述的微生物转化制备(R)-3-羟基丁酸乙酯的方法，其特征在于所述的发酵培养基各组分终浓度为：麦芽糖5～50g/L，酵母膏100～500g/L，NH₄Cl 1～10g/L、KH₂PO₄ 0.5～5g/L，K₂HPO₄ 0.5～5g/L，异于K⁺的金属离子0.1～1g/L，pH值4～9。

8.如权利要求1所述的微生物转化制备(R)-3-羟基丁酸乙酯的方法，其特征在于所述的转化液分离纯化步骤为：用乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯层脱水、脱色后，回收溶剂，得到所述(R)-3-羟基丁酸乙酯。

9.如权利要求1所述的微生物转化制备(R)-3-羟基丁酸乙酯的方法，其特征在于所述的方法按如下步骤进行：

(1)斜面培养：接种膜醭毕赤酵母菌株，斜面于28℃培养1～7天，作为斜面活化种子；

(2)种子培养：接入斜面活化种子，20～40℃，摇床转速100～250r/min，培养1～5天，作为种子液；

(3)发酵培养：接种种子液，接种量5～10％体积比，20～40℃，摇床转速100～250r/min，培养1～5天，得发酵液或湿菌体；

(4)微生物转化：将发酵液或发酵液离心收集的湿菌体，用0.1M，pH8.0的磷酸盐缓冲液清洗后，将湿菌体转入0.1M，pH8.0的磷酸盐缓冲液中，同时加入底物乙酰乙酸乙酯使底物质量浓度为1～50％，湿菌体用量为0.3～6g/g底物，并添加终浓度0.1～25g/L的葡萄糖，20～50℃、100～250r/min反应1～40小时，反应结束，离心除去菌体，上清液用乙酸乙酯萃取，再脱水、脱色，蒸发回收溶剂，得所述(R)-3-羟基丁酸乙酯。

10.如权利要求1所述的微生物转化制备(R)-3-羟基丁酸乙酯的方法，其特征在于所述方法按如下步骤进行：

(1)斜面培养：培养基各组分终浓度为：麦芽汁10g/L，酵母粉3g/L，蛋白胨5g/L，葡萄糖10g/L，琼脂20g/L，pH6.5，121℃灭菌20分钟，灭菌后冷却、制成斜面、接种膜醭毕赤酵母菌株，20～40℃培养1～7天，作为斜面活化种子；

(2)种子培养：培养基各组分终浓度为：麦芽糖30g/L，酵母膏2g/L，NH₄Cl 5g/L，KH₂PO₄ 1g/L，K₂HPO₄ 1g/L，MnSO₄·7H₂O0.5g/L，pH6.5，120℃灭菌20分钟，灭菌后冷却、接入斜面活化种子，20～40℃，摇床转速100～250r/min，培养1～5天，作为种子液；

(3)发酵培养：培养基各组分终浓度为：麦芽糖30g/L，酵母膏2g/L，NH₄Cl 5g/L，KH₂PO₄ 1g/L，K₂HPO₄ 1g/L，MnSO₄·7H₂O0.5g/L，pH6.5，120℃灭菌20分钟，灭菌后冷却、接种种子液，接种量5～10％体积比，20～40℃，摇床转速100～250r/min，培养1～5天，得发酵液；

(4)微生物转化：将发酵液离心、收集菌体，用0.1M，pH8.0的磷酸盐缓冲液清洗后，将湿菌体转入0.1M，pH8.0的磷酸盐缓冲液中，同时加入底物乙酰乙酸乙酯使底物质量浓度为1～50％，湿菌体用量为0.3～6g/g底物，并添加终浓度0.1～25g/L的葡萄糖，20～50℃、100～250r/min反应1～40小时，反应结束，离心除去菌体，上清液用乙酸乙酯萃取，再脱水、脱色，蒸发回收溶剂，得所述(R)-3-羟基丁酸乙酯。