[发明专利]一种微生物转化制备(R)－3－羟基丁酸乙酯的方法

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种微生物转化制备(R)-3-羟基丁酸乙酯的方法，属于生物催化技术领域。

(二)背景技术

3-羟基丁酸乙酯(ethy-3-hydroxybutyrate，EHB)是一种重要的药物中间体，分子中含有多功能基团，其手性单一对映异构体(R)-EHB和(S)-EHB羟基丁酸乙酯均是非常有前景的重要的手性砌块，例如(S)-EHB是熏衣草醇、食菌甲诱醇、核球壳菌、格哈菌素、卡包霉素和灰绿霉素前体等天然产物的手性源，(R)-EHB也是合成L-肉碱、亚胺培南等碳青霉烯类抗生素等手性药物的重要中间体。

由于乙酰乙酸乙酯(ethyl 3-oxobutanoate/ethyl acetoacetate，EOB)易于合成且价格低廉，以其为底物进行微生物催化的不对称还原反应获取手性EHB是非常经济有效的制备途径。而且反应产物(R)-EHB不易为微生物代谢利用，用微生物活细胞催化方法制备(R)-EHB非常有利。

目前所知的从EOB还原为手性醇的方法主要有三条路径：

(1)化学法。化学法采用的主要是过渡金属配合物作为催化剂催化C＝O基加氢生成产物。化学法可获得较高的产率，但主要缺点是反应的立体选择性偏低，且手性催化剂的制备比较困难。

(2)直接利用醇脱氢酶催化乙酰乙酸乙酯。这种方法不仅要有酶蛋白参加反应，而且还要添加价格昂贵的辅酶因子，在实际应用中受到一定的限制。

(3)微生物全细胞生物转化法(Biotransformation)。即通过完整的微生物细胞(如面包酵母)的立体选择性生物催化来实现，微生物细胞含有完整的酶系，例如酵母细胞中含有醇脱氢酶系，可以实现辅酶的原位再生，不需要另外添加昂贵的辅酶因子，但现有已知可用于乙酰乙酸乙酯不对称还原制备(R)-EHB的菌种(如红酵母、产肮假丝酵母、活性干酵母假丝酵母等)，转化率普遍较低(低于50％)。

(三)发明内容

本发明即是为了提供一种产率高、所得产物光学纯度高、产物浓度高的微生物转化制备(R)-3-羟基丁酸乙酯的方法。

为达到发明目的本发明采用的技术方案是：

一种微生物转化制备(R)-3-羟基丁酸乙酯的方法，所述方法是以乙酰乙酸乙酯为底物，以膜醭毕赤酵母(Pichia membranaef aciens Hansen)细胞为酶源，进行微生物催化不对称还原反应，反应结束后转化液经分离纯化得到所述的(R)-3-羟基丁酸乙酯。

所述膜醭毕赤酵母细胞来自：膜醭毕赤酵母经发酵培养获得的发酵液或由发酵液过滤得到的湿菌体。可将湿菌体加入含有底物的溶液中，或直接按需要量将底物加入发酵液中，作为反应体系。

所述的微生物细胞催化的不对称还原反应的反应温度为20～50℃，反应时间为1～40小时。在此条件下所得的转化液采用气相色谱分析(GC)测定产物浓度，再结合产物的旋光测定得到产物e.e.值，表明已转化的主要组分为(R)-EHB。

所述底物质量浓度为1～50％，加入发酵产物使湿菌体量为0.3～6g/g底物，所述不对称还原反应的反应温度为20～50℃，反应时间为1～40小时。

所述反应体系还可添加葡萄糖，添加量为0.1～25g/L。

优选的，所述不对称还原反应在0.1M，pH 8.0的磷酸缓冲液中进行。

所述的发酵产物按如下方法制得：在发酵培养基中接种膜醭毕赤酵母菌种，接种量体积比5～10％，温度20～40℃，培养1～5天后，得发酵液、或将发酵液过滤得所述湿菌体。