[发明专利]马铃薯病毒和类病毒检测试剂盒及应用

权利要求书

1.一种马铃薯病毒和类病毒的复合RT-PCR检测试剂盒，由组分I和组分II组成；组分I和组分II中的各试剂单独分装，组分I由将马铃薯病毒或类病毒RNA逆转录为cDNA第1链的必需试剂所组成，包括：逆转录酶、RNA酶抑制剂，dNTP混合物，检测对象的cDNA第1链的互补引物，反应缓冲液；组分II由进行PCR扩增的必需试剂所组成，包括：PCR反应缓冲液，dNTP混合物，MgCl₂，Taq DNA聚合酶，PCR复合引物组合；

其特征在于：所述的检测对象的cDNA第1链的互补引物是由以下7个引物按照任意比例组成的混合物：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ IDNO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：14；

所述的PCR复合引物组合是由以下7对引物所组成：SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2(引物对1)；SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4(引物对2)；SEQ ID NO：5、SEQID NO：6(引物对3)；SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8(引物对4)；SEQ ID NO：9、SEQ IDNO：10(引物对5)；SEQ IDNO：11、SEQ IDNO：12(引物对6)；SEQ IDNO：13、SEQ ID NO：14(引物对7)。

2.按照权利要求1的RT-PCR试剂盒，其特征在于：所述PCR复合引物组合中7对引物的组成比例是：引物对1∶引物对2∶引物对3∶引物对4∶引物对5∶引物对6∶引物对7＝1∶1∶2∶1∶2∶2∶0.5。

3.按照权利要求1的RT-PCR试剂盒，其特征在于：组分I的组成为：50μM合成cDNA第1链的引物0.5-5000μL，反应缓冲液1-5000μL，RNA酶抑制剂0.5-5000μL，10mmol·L^-1 dNTPs 0.2-5000μL，200 U·μL^-1 M-MLV反转录酶0.5-5000μL；组分II的组成为：PCR反应缓冲液1-5000μL，25mM MgCl₂0.1-5000μL，10mM dNTPs 0.1-5000μL，50μM PCR复合引物组合0.1-5000μL，TaqDNA聚合酶0.1-5000μL。

4.按照权利要求1的RT-PCR试剂盒，其特征在于：组分I的组成为：50μM合成cDNA第1链的引物0.5-5000μL，反应缓冲液1-5000μL，40U·μL^-1RNA酶抑制剂0.5-5000μL，10mmol·L^-1 dNTPs 0.2-5000μL，200U·μL^-1M-MLV反转录酶0.5-5000μL；组分II的组成为：PCR反应缓冲液1-5000μL，25mM MgCl₂ 0.1-5000μL，10mM dNTPs 0.1-5000μL，50μM PCR复合引物组合0.1-5000μL，Taq DNA聚合酶0.1-5000μL。

5.按照权利要求1的RT-PCR试剂盒，其特征在于：组分I中还包括无RNA酶的去离子水；组分II中还包括有马铃薯卷叶病毒、马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒、马铃薯S病毒、马铃薯A病毒和马铃薯纺锤块茎类病毒混合物的无侵染活性的阳性对照。

6.权利要求1的RT-PCR试剂盒在检测马铃薯卷叶病毒、马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒、马铃薯S病毒、马铃薯A病毒和马铃薯纺锤块茎类病毒中的应用，包括：(1)将马铃薯待检样品RNA用组分1的试剂按照常规的反应条件逆转录合成cDNA第1链；(2)将cDNA第1链用组分II的试剂按照常规的反应条件进行PCR扩增；(3)结果判定：将PCR扩增产物进行5％聚丙烯酰胺凝胶电泳；如果样品仅扩增出了190 bp片段，则为健康样品；若样品无190 bp的DNA带出现，则为假阴性样品，需要继续进行检测确定；若样品扩增产物中，190 bp片段和其它片段同时出现，则为感病样品，其中马铃薯X病毒的扩增带为520 bp，马铃薯Y病毒的扩增带为420 bp，马铃薯A病毒的扩增带为410 bp，马铃薯纺锤块茎类病毒的扩增带为360 bp，马铃薯S病毒的扩增带为310 bp，马铃薯卷叶病毒的扩增带为270 bp。