[发明专利]马铃薯病毒和类病毒检测试剂盒及应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种试剂盒，尤其涉及一种马铃薯病毒和类病毒的复合RT-PCR检测试剂盒，本发明还涉及该试剂盒的制备方法及应用技术操作规程，属于植物病毒检验、检疫领域。

背景技术

马铃薯(Solanum tuberosum L.)是我国应用价值较高的经济作物，种植面积居世界第一位，面积已达6600万亩，总产量5609.6万吨。马铃薯适宜栽培区域广泛，但病毒病害严重影响了马铃薯的产量和品质，在我国引起马铃薯退化的主要病毒有马铃薯卷叶病毒(Potato leafroll virus，PLRV)、马铃薯X病毒(Potato virusX，PVX)、马铃薯Y病毒(Potato virus Y，PVY)、马铃薯S病毒(Potato virus S，PVS)、马铃薯A病毒(Potato virus A，PVA)和马铃薯纺锤块茎类病毒(Potato spindle tuberviroid，PSTVd)，且多数是复合感染。

马铃薯已被列为我国7大作物之一，也是中国西部最重要的作物品种和主要的支柱型产业，发展势头良好，但目前我国马铃薯单产只有发达国家平均单产的1/3，马铃薯病毒是造成马铃薯产量低、质量差的主要原因。目前生产上普遍采用马铃薯脱毒种薯来防治病毒病的危害，为确保马铃薯原原种、原种的脱毒质量，建立快速、准确、灵敏、高效的马铃薯病毒类病毒检测技术是马铃薯种薯生产的关键技术环节，也是马铃薯产业良性发展的迫切需要。

国内马铃薯病毒检测主要是山东农科院和国际马铃薯研究中心提供的ELISA检测试剂盒，这种酶联免疫检测技术依赖于抗血清，血清大多依赖进口，价格高，不适合生产的需要，且免疫学检测技术的灵敏度低和准确性差，在生产上应用具有较大的局限性，极大地限制了我国马铃薯种薯生产病毒检测的普及和应用；同时ELISA不能准确的检测到休眠块茎中的PLRV和PVY病毒，在检测前需打破休眠；此外，对于不具有免疫原性的PSTVd类病毒来说，根本无法使用ELISA技术进行检测。因此生产上迫切需要一种全面、快速、简便、灵敏、廉价的检测技术。

聚合酶联式反应(Polymerase chain reaction，PCR)与ELISA检测相比具有灵敏度高、特异性强和准确可靠及稳定性好的特点，被认为是病毒检测技术的一次革命，已在许多植物病毒上应用。常见的马铃薯病毒大多是单链RNA病毒，需要先将病毒RNA反转录后再进行PCR扩增，即反转录聚合酶链式反应(Reverse-transcriptionPolymerase Chain Reaction，RT-PCR)技术。随着分子生物学技术的不断发展，近年来已由一次只能检测一种病毒的单一RT-PCR技术发展到可以同步检测两种至多种病毒的双重PCR(d-RT-PCR)、复合RT-PCR(m-RT-PCR)检测。复合RT-PCR检测技术可以同时检测多种病毒和类病毒，在大大提高检测的准确性和灵敏度的同时，还大大降低了检测的成本、缩短了检测时间，成为马铃薯病毒类病毒RT-PCR检测的方向和主流。加拿大科学家Nie等曾经探讨用随机引物进行马铃薯主要病毒和类病毒的复合RT-PCR检测研究，国内王中康等也开展了有关研究。但是他们都没有对病毒检测过程中存在的假阴性结果的问题提出有效解决的办法，没能构建一种试剂盒来同时检测马铃薯的5种病毒和1种类病毒。研究马铃薯的5种病毒和1种类病毒同步快速RT-PCR检测，解决RT-PCR检测过程中易出现假阴性结果的问题，解决同时检测马铃薯病毒和类病毒的问题，解决脱毒马铃薯产业发展的限制性问题都具有重要的意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有检测方法不能同时检测马铃薯病毒和类病毒，检测成本高，时间长的问题；克服RT-PCR检测中的假阴性问题，提供一种新的马铃薯病毒和类病毒的复合RT-PCR检测试剂盒，来同时检测马铃薯病毒和类病毒，且快速、简便、灵敏、廉价。

本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：

一种马铃薯病毒和类病毒的复合RT-PCR检测试剂盒，由组分I和组分II组成，组分I由将马铃薯病毒和类病毒mRNA逆转录为cDNA第1链的必要试剂所组成，包括：逆转录酶、RNA酶抑制剂，dNTP混合物，检测对象的cDNA第1链的互补引物，cDNA第1链反应缓冲液；组分II由以cDNA第1链为摸板进行PCR扩增的必要试剂所组成，包括：PCR反应缓冲液，dNTP混合物，MgCl₂，Taq DNA聚合酶，复合PCR引物组合等；