[发明专利]以植物多酚类物质为底物酶法合成黑色素

说明书

技术领域

本发明属于生物化工领域，生物化学制品范围，用茶多酚为反应底物，通过酶促合成黑色素(Melanins)。

技术背景

黑色素是生物的保护性色素，广泛存在于动物、植物和微生物中，黑色素有吸收紫外线、抗氧化、消除自由基的作用，对生物有机体起着保护作用。按黑色素的结构组成，可分为三种型式，即真黑色素(eumelanin)、棕黑色素(phaeomelanin)和异黑色素(allpmelanin)。真黑色素颜色为深棕色或黑色，由酪氨酸经由多巴(Dopa)途径转化而生成，这种黑色素主要分布于动物表皮和毛发细胞中，以及内脏膜或组织中，可称为动物型黑色素。棕黑色素是真黑色素的胱氨酸衍生物，含硫原子，颜色为略带红色的棕色或黄色，常见于动物的毛发中。异黑色素主要分布于植物中，属植物型黑色素，类似于真黑色素为棕色或黑色，它主要是由儿茶酚等二元酚、三元酚经由多聚羟基萘途径生成的。

黑色素是一种天然色素，在轻工、化工、食品、化妆品等方面有重要的用途。目前制取黑色素有3种方法，一是从粮食如黑豆、黑芝麻、高粱等种皮和动物毛发、表皮分离提取的，产量小，成本高，纯度低；二是发酵黑酵母(Saccharomyces niger Marpm)从酵母菌体分离制取的，菌种分离困难，设备复杂，投资巨大。三是通过酶法和化学法合成黑色素，如以酪氨酸为底物酶促合成动物型黑色素，以一元酚和二元酚为底物合成植物型黑色素。但迄今未见有关利用植物多酚类物质为底物合成黑色素的报道，用植物多酚类物质合成的黑色素由于其前体物的结构特殊性，使得其合成的黑色素在医药和环保方面有着更大的用途。本发明利用植物多酚类物质为底物，酶促反应法生产黑色素，简便易行、生产成本低、投资小、设备简单、产品纯度高。

发明内容

在反应容器中加入介质缓冲液、反应催化剂多分氧化酶和植物多酚类物质，组成酶促反应系统，在最适宜的pH、温度、催化剂浓度、底物浓度和供氧条件下进行酶促合成黑色素反应。反应结束后加入酸，使黑色素沉淀析出，再经酶解或酸解处理，消化掉与黑色素混杂的蛋白质，获得黑色素纯品。

黑色素制备：将植物多酚类物质溶于0.05％碳酸氢钠溶液中，在水浴上加热溶解，冷却至40℃，加入反应催化剂。在38～40℃保温40～60分钟进行反应，期间进行充分供氧。反应混合液逐渐由红褐色变成黑色。待反应结束后，用6M盐酸调节pH＜3，酶蛋白和黑色素一起沉降到瓶底，过滤收集沉淀，得黑色素粗产物。再经稀酸、稀碱洗涤后，再用水洗至中性。将洗至中性的黑色素粗制品置于烧瓶中，加适量6N HCl洄流8～20小时，水解其中的蛋白质，放置冷却，过滤出黑色素，用稀碱洗涤，最后水洗至中性，60℃烘干，即得黑色素。

具体实施方式

实例1.

多酚氧化酶的制备：将250g新鲜马铃薯洗净，切成小块，加入少量石英砂和pH7.8的磷酸缓冲液1000ml，在高速捣碎机中匀浆2分钟，80-120目尼龙布过滤，滤液4-6℃静置0.5-2小时，待淀粉沉淀到底部后，倾出上清液，加入达到70％饱和度的硫酸铵，离心收集沉淀，得多酚氧化酶抽提物，得到多酚氧化酶1，置冰箱中保存备用。

500g新鲜蘑菇，加入500ml甘油，用高速捣碎机(10000rpm)匀浆捣碎1分钟，200目尼龙布挤滤，弃去滤渣，得到多酚氧化酶2，置于5℃冰箱中保存备用。

实例2.

0.1g茶多酚溶于200ml磷酸缓冲液pH8.0中，在水浴中加温至38～40℃，加入蘑菇匀浆液5～15ml，快速搅拌，充足供氧，反应混合液很快变成红色，随时间延长，由红色变成褐色，最后为黑色，继续保温40～60分钟，滴加6N盐酸停止反应，黑色素随酶蛋白沉淀下来。经抽滤，沉淀于60℃烘干得黑色素粗制品0.091克。

实例3.

0.2g葡萄多酚加入磷酸缓冲液1000ml pH8.0中，加热至溶解，冷却至40℃，加入上述多分氧化酶125-30毫克，边保温边搅拌，充足供氧，40℃保温1小时后，6N盐酸调节反应液pH＜3，出现黑色絮状沉淀，抽滤，水洗3～5次，60℃烘干，得黑色素粗产物0.094g。

实例4.

0.1g苹果多酚溶于200ml磷酸缓冲液pH8.0中，在水浴中加温至38～40℃，加入蘑菇匀浆液5～15ml，快速搅拌，充足供氧，反应混合液很快变成红色，随时间延长，由红色变成褐色，最后为黑色，继续保温40～60分钟，滴加6N盐酸停止反应，黑色素随酶蛋白沉淀下来。经抽滤，沉淀于60℃烘干得黑色素粗制品0.089克。

实例5.