[发明专利]一种检测巯基嘌呤甲基转移酶基因型的试剂盒及方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种巯基嘌呤甲基转移酶基因型检测试剂盒和方法。更具体的，本发明涉及通过聚合酶链式反应-限制性酶切片段长度多态性方法，提供一种分析编码巯基嘌呤甲基转移酶(TPMT)的基因位点多态性的试剂盒和方法。

背景技术

嘌呤类药物，包括6-巯基嘌呤(6-MP)，6-巯代鸟嘌呤(6-TG)和巯唑嘌呤(AZA)是临床常用的肿瘤化疗药物，并且广泛用于治疗各种类型的白血病。除白血病以外，嘌呤类药物还被广泛用于治疗肠炎，风湿性关节炎，器官移植和系统性红斑狼疮等。它们通过干扰体内的核酸代谢，包括核酸的从头合成和补救合成途径发挥作用。嘌呤类药物是无内在生物活性的药物，必须通过体内一系列代谢后才能发挥抗白血病效应。部分使用嘌呤类药物的患者出现严重的毒副作用，主要表现是骨髓抑制和白细胞减少。

研究表明，嘌呤类药物的疗效和TPMT活性密切相关，临床研究表明，6-MP，6-TG以及AZA的临床疗效及不良反应和TPMT活性相关。TPMT活性高的个体，用药后生成活性代谢产物-巯基鸟嘌呤磷酸盐(TGNs)的浓度低，因此疾病的复发率高；而对于TPMT缺陷的个体，医用常规剂量的嘌呤类药物也会导致体内巯基鸟嘌呤磷酸盐的积累，产生严重的毒副作用如严重骨髓抑制和肝损害等，最终导致治疗的被迫中断，造成治疗的失败(Coulthard SA，Howell C，Robson J，et al.Blood，1998，92：2856-2862；Relling MV，Hancock ML，Boyett JM，et al.Blood，1999，93：2817-2823)。

人类TPMT基因总长为3.4kb，编码序列总长2.7kb，开放阅读框架含735个碱基。编码的TPMT的分子量大约为30000。由245个氨基酸残基组成。经研究发现，TPMT基因有3个重要的位点，分别是核苷酸序列中第238位点、第460位点和第719位点。当三个位点发生突变，即第238位的鸟嘌呤(G)→胞嘧啶(C)，结果使得氨基酸序列第80位的Ala(丙氨酸)→Pro(脯氨酸)，第460位的鸟嘌呤(G)→腺嘌呤(A)，使得氨基酸序列第154位的Ala(丙氨酸)→Thr(苏氨酸)，第719位的腺嘌呤(A)→鸟嘌呤(G)，使第240位的Tyr(酪氨酸)→Cys(半胱氨酸)。突变诱导的TPMT酶活性的减低或丧失，导致在使用嘌呤类药物时形成高浓度的TGNs，引起明显的造血组织细胞毒性，产生严重后果，甚至引起死亡(Tai HL，Krynetski EY，Yates CR，et al.Am J Hum Genet，1996，58：694-702；KrynetskiEY，Schuetz JD，Galpin AJ，et al.Proc Natl Acad Sci USA，1995，92：949)。

研究发现，TPMT的基因型和其酶活性之间有很强的相关性，根据TPMT基因多态性和酶活性的关系，可以通过检测患者TPMT的基因型，推测患者体内TPMT酶活性的高低，预测不同患者对于嘌呤类药物的疗效和副作用，为医生提供用药时的参考。

根据国内外的文献报道，检测TPMT基因多态性的方法主要有荧光定量PCR方法、等位基因特异性PCR(allele specific PCR)、PCR-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)、变性高效液相色谱分析(DHPLC)、SNaP shot定点序列分析检测以及基因序列测定等分析方法。

目前上市的产品主要应用荧光定量PCR的方法检测TPMT的多态性，荧光定量PCR方法具有准确率高，操作简便的优点。但是它致命的缺点是检测所需要的荧光定量PCR仪设备昂贵，国内只有极少数科研院所和大型医院有此设备。此外，检测所用的荧光标记探针和引物造价较高，一般的患者难以承受。

Szumlanski等利用等位基因特异性PCR，针对TPMT中单核苷酸多态性位点设计引物，通过控制PCR过程中的退火温度等PCR条件使得野生基因型可以得到PCR产物而突变型不能得到产物(Szumlanski C，Otterness D，et al.DNA Cell Biol，1996；15：17-30)。但在后期的验证实验中，马晓莉等发现，由于假阳性的存在，这一方法并不能有效的区分野生型和突变型(MA Xiao Li，ZU Ping，et al.Journal of Experimental Hematology2003；11(5)：458-463)。