[发明专利]一种筛选方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种使用质谱分析(MS)筛选变体肽的方法。本发明还涉及实施该方法的系统和试剂盒。

背景技术

质谱分析被证明是测定包括生物分子在内的多种分子的分子结构最有价值的工具，而且在当今被广泛地应用。该技术包括在检验中用电子或其他的高能量粒子轰击分子种(molecular species)，其引起分子的电离和断裂，从而，导致改变了电荷和质量的电离粒子的广谱化。温和电离技术，例如电喷射，能够引起电离但基本不引起分子的断裂。该技术在生产多电荷种类的蛋白质和肽中尤其具有价值。如通常所实行的，产生的复杂质量/电荷光谱转变成电脑产生的去卷积光谱(deconvoluted spectrum)，该光谱具有各多肽的单质峰。目前质谱分析的进展主要集中于去卷积分析所需的最有效的软件的开发。尽管这方面的技术在继续改善，但是，这仍然是最需要的并且是每个特定的测定过程中费时的部分。去卷积分析的应用已经成为阐明预先未知的或不确定的分子结构的质谱分析中所不可缺少的，但是业已证明，其难以简化目前的方法以显著地减少执行所需的时间。

质谱分析还可以用于检测牵涉严重紊乱的变体蛋白质和多肽。例如，血红蛋白的多肽亚单位的多种变体或突变体形式是已知的，并且能够导致各种形式的贫血症，而且许多这种突变是仅仅1个氨基酸。文献中已经记载了这些蛋白质的基本分子结构和氨基酸序列，以及编码它们的DNA中的相应突变。

质谱分析还可以用于遗传代谢紊乱(IMD)的群体筛选(Chase et al.，Clin.Chem.，49，1797-1817，2003)。

在人类中，血红蛋白病是最常见的遗传紊乱。这些紊乱源于球蛋白基因的突变，并且，业已描述了超过800种血红蛋白变体(Huisman et al，HumanHaemoglobin Variants，2nd Edn.，Augusta，GA：Sickle Cell Anemia Foundation1998)，其中有很多没有临床意义。血红蛋白变体通常检测作为麻醉前筛选或新生儿以及出生前筛选方案。导致临床症状的变体还可以进行鉴定以作为诊断研究的部分。近期，已经扩展至目前新生儿和出生前筛选方案的健康启动项目，已经显著地增加了工作量(The NHS Plan July 2000，command paper4818)。它们也导致了对专门用于那些认为临床上显著的血红蛋白变体的检测系统的需要。两个方案具有不同的目标。出生前筛选的目标是鉴定那些对胎儿具有遗传风险的血红蛋白病携带者。因此，目标是检测镰刀形血红蛋白的存在或缺乏和β地中海贫血症或与它们互相作用的血红蛋白变体中的一种，例如，Hb C，Hb D^Punjab，Hb O^Arab，Hb Lepore和Hb E。另外，还包括3种潜在的临床显著的其他的条件，即δβ地中海贫血症、胎儿血红蛋白症(HPFH)的遗传性持续和α-0地中海贫血症(alpha zero thalassaemia)。新生儿筛选的目标是对个体进行镰刀形红细胞贫血病和β地中海贫血症的早期鉴定，以启动治疗。

经典的血红蛋白病生化诊断使用电泳技术或阳离子交换色谱产生的表型信息(Working Party Of General Haematology Task Force，1998)。这些形成了目前筛选技术的基础；然而，它们是缓慢的、费力的且非特异性的。并且，它们是非靶向的，并因此将检测筛选方案所不需要的血红蛋白变体。对于群体筛选，电喷射四极场质谱分析(MS)具有更快的速度、更强的特异性和更好的经济效益。

大多数公开的使用MS表征血红蛋白病的方法，业已使用全血扫描来确定完整的球蛋白链的质量，随后进行胰蛋白酶消化和肽的分析(Wild et al，Blood Cells，Molecules and Diseases，27，691-704，2001)。这种方法有能够明确地表征大多数球蛋白突变。

文献Wild et，al，2001，(上文)详述了MS方法，尤其是第693页和图2，第697页的方法部分，显示了用于正常的和一个特定的变体β血红蛋白链的去卷积ESI质谱。Wild et al，2001，(上文)的第698页的表1列举了，核苷酸编码三联体中的单个碱基改变所产生的多种质量和氨基酸改变，该改变可以通过MS方法测定。