[发明专利]分离核酸的方法，该核酸在提高的温度下固定于基质上

说明书

本发明涉及一种改进的分离核酸的方法。

通常根据如下统一的基本模式从植物细胞、动物细胞或人类细胞以及细胞培养 物或病毒培养物中分离核酸(如DNA和RNA)：首先部分地采用蛋白降解酶类消化 含有核酸的原材料。各个组分即可以在随后步骤中通过多种不同方法进行分离。

不可避免地存在于每种细胞裂解液中的蛋白质片段的分离是一个尤其重要的 步骤。该分离可以通过，例如，使蛋白质/核酸混合物接触苯酚和/或氯仿/异戊醇来 进行。还可以通过添加诸如盐酸胍或异硫氰酸胍的变性盐类将蛋白质片段从水相中 沉淀出来。还可以通过添加蛋白酶并随后除去以降解该蛋白质。最终通过选择性添 加DNA酶或RNA酶来除去不想要的核酸，并得到各自所需的核酸。然而，为了 防止核酸在分离过程中遭受不必要的酶性降解，必须在无菌和无核酸酶的条件下进 行操作。核酸的分离也可以通过超速离心来实现。

大部分现有技术的方法均基于以下两种分离原理之一：

“传统方法”是基于一种单阶段过程，其中，在添加缓冲液(其在大多情况下包 含胍盐)和有机提取剂(大多为氯仿或苯酚)之后进行提取。不需要的附带材料然后与 有机相一起被除去。留在水相中的核酸然后可通过相分离分开并分离。

该方法的主要缺点是，除了使用有毒和有害健康的物质(如异硫氰酸胍、苯酚或 氯仿)之外，作为杂质留在核酸水溶液中的水溶性材料必须在额外的、非常耗时的 纯化步骤中分离。该问题让使用此方法从植物中分离核酸变得复杂，例如，这是因 为这些植物中大多含有相当量的多糖和此类水溶性物质。

考虑到这些缺点，现有技术中还有一种可选的方法，该方法基于将核酸选择性 吸附到固态(通常为矿物质)载体上(如二氧化硅)。在这种多阶段过程中，不同的缓 冲液(裂解、结合、洗涤和洗脱缓冲液)被依次加入细胞或病毒裂解液；最后步骤中， 从载体上将纯化的核酸洗脱下。

同时，专家圈已经研究过在存在离液盐时核酸结合到矿物质载体的物理化学原 理。他们认为核酸结合到矿物质载体表面是基于水环境高度有序的结构的破坏，核 酸因此才吸附到矿物质材料(尤其是玻璃颗粒和二氧化硅颗粒)表面。

上述方法的一个特别不利之处在于，当使用由特别高比例的伪二级原料 (spurious secondary material)增强的样品时，为了得到期望的高纯度，必须考虑合理 的得率损失。

因此，本发明的目的是提供一种不存在上述从现有技术中得知的缺点的分离 RNA或DNA的方法，并提供高得率和高纯度的核酸。

我们激动地发现，如果含有核酸的溶液在结合之前或结合时被加热，那么在存 在离液剂和/或醇时，尤其当存在离液剂和醇时，核酸与二氧化硅颗粒(优选磁性二 氧化硅颗粒)的结合便能得到改进。所述改进对病毒RNA、DNA和人工合成的 RNA，以及其它核酸种类均特别有效。

本发明的生物材料应该理解为粒子或分子基原料。尤其包括病毒、噬菌体和细 胞(例如，细菌细胞、以及人类细胞、动物细胞(如白细胞)或植物细胞)。尤其地， 本发明的方法优选地适合于从人或动物来源(例如，临床样品如血液、血浆、血清、 漱口水、尿液、脑脊髓液、痰、粪便、穿刺(punctates)上皮、涂片、活检和其它组 织或骨髓样品)的样品原料中分离核酸(如DNA或RNA)。

样品还可以来源于环境分析、食品分析或分子生物学研究中，例如，来自细菌 培养物、病毒培养物、噬菌体裂解液、气体或水过滤物和扩增产物(如PCR)。

天然或修饰的生物材料可以用本发明的方法进行分离。天然生物材料应该理解 为与自然发生的生物材料相比，其结构未经不可逆地修饰的材料。然而，并不排除 样品的其它组分的修饰。例如，当需要分离细胞时，需要真正改变细胞周围的介质， 而非细胞本身。当需要分离核酸时，其也应该是以天然形式，即未经切割或通过在 其上偶联反应性基团而修饰。因此，定义的天然生物材料尤其不含生物素化的核酸。 其中，病毒DNA、病毒RNA或来自人或动物样品材料的细胞核酸是天然生物材料 的具体例子。

修饰的生物材料包括不天然发生的材料，例如通过附加反应性、可检测的或稳 定化基团或固定基团进行修饰的核酸，例如生物素化的核酸；此外还有合成的DNA 和RNA，例如‘武装(armored)RNA’。