[发明专利]基因RCS 23

说明书

本发明涉及新鉴定出的基因，其编码L-抗坏血酸(下文中也称为维生素C)合成中涉及的蛋白质。本发明还涉及：包含该新颖基因的全长多核苷酸序列的多核苷酸及其片段，所述多核苷酸编码的新颖的多肽及其片段，以及它们的功能等同物。本发明还涉及所述多核苷酸和多肽作为生物技术工具在从微生物生产维生素C中的用途，其中对所述多核苷酸和/或被编码的多肽的修饰对在所述微生物中生产所述发酵产物的产率、产量和/或效率有着直接或间接的影响。本发明还包括使用所述多核苷酸和经修饰的多核苷酸序列转化宿主微生物的方法/工艺。本发明还涉及经过遗传工程改造的微生物及其用于直接生产维生素C的用途。

维生素C是对人类来说非常重要且必不可少的营养因子。维生素C还用于动物饲料，尽管一些畜牧动物可自身体内合成维生素C。

在过去的70年中，已通过公知的Reichstein方法从D-葡萄糖对维生素C进行了工业生产。该工艺中的所有步骤都是通过化学方式进行的，只除了其中一个步骤(从D-山梨糖醇到L-山梨糖的转化)，其通过微生物转化来进行。从对维生素C的工业生产的最初实践开始，就已使用了多种化学改良和技术改良，来提高Reichstein方法的效率。近来对维生素C生产的发展被概括于Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry，5th Edition，Vol.A27(1996)，pp.547ff中。

维生素C生产的不同中间步骤已在微生物或从中分离出的酶的协助下进行。因此，可通过发酵工艺，通过属于例如Ketogulonicigenium属或Gluconobacter属的菌株从L-山梨糖或D-山梨糖醇起始来生产2-酮基-L-古洛酸(2-KGA，这是可通过碱性重排反应化学转化为维生素C的中间产物)，或者通过属于Gluconobacter属或Pantoea属的重组菌株，从D-葡萄糖起始进行另一种发酵工艺来生产2-酮基-L-古洛酸。

目前用于对维生素进行化学生产的方法具有一些人们不想要的特征，例如高能耗以及要使用大量的有机及无机溶剂。因此，在过去数十年中，人们已在研究更加经济且环保的用微生物转化来制造维生素C的其它方法。

从大量底物(包括D-山梨糖醇、L-山梨糖和L-山梨糖酮)来直接生产维生素C已在多种微生物中被报道过，所述微生物例如藻类、酵母和乙酸细菌，其中使用了不同的培养方法。已知能直接生产维生素C的细菌的例子包括，例如，来自Gluconobacter、Gluconacetobacter、Acetobacter、Ketogulonicigenium、Pantoea、Pseudomonas或Escherichia属的菌株。已知酵母或藻类的例子包括，例如Candida、Saccharomyces、Zygosaccharomyces、Schizosaccharomyces、Kluyveromyces或Chlorella。

能吸收D-山梨糖醇用于生长的微生物通常具有能将该化合物氧化为普遍性的同化吸收底物(例如D-果糖)的酶。能在L-山梨糖上生长的微生物还拥有一种酶——NAD(P)H-依赖性L-山梨糖还原酶，该酶可将该化合物还原为D-山梨糖醇，D-山梨糖醇再被进一步氧化为D-果糖。被D-果糖激酶磷酸化之后，D-果糖成为很多微生物生长的优秀底物。

例如，在乙酸细菌(其是专性需氧的革兰氏阴性微生物，属于Acetobacter、Gluconobacter和Gluconacetobacter属)的情况下，这些微生物能将D-山梨糖醇转运进胞质溶胶(cytosol)，并通过胞质溶胶中的NAD-依赖性D-山梨糖醇脱氢酶将其转化为D-果糖。一些个体菌株，例如Gluconobacter oxydans IFO 3292和IFO 3293还能将L-山梨糖转运进胞质溶胶，并通过胞质溶胶中的NAD(P)H-依赖性L-山梨糖还原酶将其还原为D-山梨糖醇，D-山梨糖醇再被进一步氧化为D-果糖。在这些细菌中，Embden-Meyerhof-Parnas途径以及三羧酸循环并不具有完全活性，将糖导向中央代谢的主要途径是磷酸戊糖途径。通过磷酸化反应从D-果糖获得的D-果糖-6-磷酸进入磷酸戊糖途径，其被进一步代谢，产生以NAD(P)H形式存在的还原能量和生长及维持所必需的三羧基化合物。