[发明专利]用于肿瘤治疗的黄病毒复制子结构

说明书

技术领域

本发明涉及一个基于黄病毒复制子的表达结构，其用于运载和表 达粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)。更特别的，本发明涉及用 于运载和表达GMCSF以治疗肿瘤的基于库京(Kunjin)病毒复制子的 表达结构。

背景技术

GMSCF是一个可以用于治疗癌症的有潜在价值的细胞因子。例如， 当把转染后能表达重组GMCSF的B16黑色素瘤细胞用放射线辐射后注 射给裸鼠可以作为活的全细胞疫苗。这些被免疫的小鼠可以得到保护， 经受住随后B16肿瘤细胞的攻击。这些起初为预防疾病而进行的小鼠 实验为人类癌症治疗的试验提供了相同的策略。

接种分泌GMCSF的辐射后黑色素瘤细胞疫苗可以通过募集树突状 细胞和巨噬细胞来提高肿瘤抗原的提呈从而增强宿主的免疫反应。这 导致癌症特异的CD8T细胞被诱导，而CD8T细胞可以攻击癌细胞 (Dranoff，2003，Oncogene 22 3188-92)。这种全细胞免疫的策略是 复杂的，它需要产生和接种活的转染后肿瘤细胞系作为疫苗给病人 (Ellem等，1997，Cancer Immunol Immunother.44 10-20)。大量的 疫苗形式已经被研究，揭示了GMCSF的特性(Chang等，2004， Hematology 9 207-15)。

在这些方法中，潜在的最大利用领域是直接的肿瘤内和/或近肿瘤 注射病毒载体，其能够感染癌症细胞和/或周围的细胞并引起这些细胞 产生重组GMCSF。这些方法不需要体外产生细胞并且已经显示了一些对 许多不同癌症进行肿瘤治疗的前景。(Triozzi等，Int J Cancer.2004 28；Yang等，2003，Cancer Res.63 6956-61；Parkinson等，2003， Prostate 56 65-73；Pan等，2004，Cancer Immunol Immunother.53 17-25).

虽然前景光明，但目前的系统在治疗肿瘤上并不能使人信赖。因 此，这个领域的许多人正在通过寻求和其它抗癌形式的协同作用来达 到改善肿瘤治疗的目的。然而，这些方法在反复试验的基础上被典型 地采用，所以一个有预见性的科学就仍然需要出现。

发明内容

发明目的

本发明的目的是提供一个改良的肿瘤治疗体系，在该体系中利用 了GMCSF的运载。

发明人最近已经发现利用黄病毒复制子表达结构进行GMCSF的运 载在GMCSF介导的肿瘤治疗中是具有独特的效果，其中黄病毒复制子 表达结构不只局限于库京病毒复制子病毒结构。更为特别的是，包括 在非结构蛋白的复制子编码中含有突变的结构的库京病毒复制子疗效 是尤其明显的，所述非结构蛋白的复制子编码例如，但不局限于NS2A， 这很可能是通过诱导增加IFNα/β和/或其它炎症因子的分泌水平， 并与重组的GMCSF协同作用来达到增强肿瘤治疗效果的目的。

因此，本发明广义的涉及(is broadly directed)GMCSF的运载， 利用了诸如但不局限于库京病毒复制子结构的黄病毒复制子结构，用 于预防或治疗肿瘤或癌症。

在第一方面，本发明提供了一个黄病毒复制子结构，包含一个核 苷酸编码序列：

(i)一个不能产生感染病毒的黄病毒复制子；和

(ii)粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)。

黄病毒复制子的结构可以是RNA或DNA形式。

在一个首选的实施方案中，核苷酸序列编码一个在所述复制子的 一个非结构蛋白中有一个或多个氨基酸突变、缺失或替代的黄病毒复 制子。

优选的所述的非结构蛋白选自NS2A、NS2B、NS3、NS4A或NS4B。

优选的所述的在黄病毒非结构蛋白中一个或多个的氨基酸突变、 缺失或替代是选自：

(I)非结构蛋白NS2A第30位丙氨酸突变为脯氨酸；和

(II)非结构蛋白NS2A第101位天冬酰胺突变为天冬氨酸或谷 氨酸。

本发明也涵盖在所述复制子的一个或多个各自的非结构蛋白中有 一个或多个其它氨基酸突变、缺失或替代；与野生型黄病毒复制子编 码的非结构蛋白相比，在动物细胞中，这些突变、缺失或替代增强诱 导IFNα/β或其它致炎(炎症前)细胞因子或化学因子。