[发明专利]有机化合物

说明书

发明领域

本发明涉及有机化合物，并且涉及用于鉴定调节mRNA与靶蛋白质如ELAVL1蛋白之间相互作用的物质的测定法。

技术背景

大量基因的表达在信使RNA水平上受到控制。特别地，与某些刺激具有疾病相关性的早期应答基因从而是多种靶标的快速应答通常因转录后控制机制而得以促进。这些过程主要由对信使RNA起作用的调控蛋白质或因子介导。抑制或调节这类调控性靶mRNA-蛋白质的相互作用代表了有吸引力的治疗性干预手段。

为了寻找抑制mRNA调控的低分子量抑制剂，需要一种监测靶向mRNA-蛋白相互作用的测定法，理想地是在均质溶液中进行。所述测定法应还适合于在高通量筛选(HTS)环境中实施，高通量筛选目前大部分通常基于荧光检测。

相对小的蛋白质，如mRNA稳定蛋白质HuR(36kD)，与长mRNA或亚片段(281-1643个核苷酸，100-500kD)的直接结合，不能基于大小的相对增加来检测，因为荧光标记的RNA在复合物形成时衰减。有鉴于此，可以容易地排除基于转动或平移扩散时间检测的光谱法(例如荧光相关光谱(FCS)、2D-FIDA-各向异性或其他荧光偏振测量法)。

本发明的测定法代表了一种在真正平衡条件下监测均质溶液中的mRNA-蛋白质相互作用的新方法。例如该法应用高度敏感的单分子检测法，由此直接适合于HTS平台如Evotec MarkII/III。由于所述检测如共焦检测具有高灵敏度和精确度，所以本发明的测定法代表了有吸引力的不同于常规电泳迁移率变动分析、滤膜结合试验或核酸酶保护分析的可选方案。适应常规的宏观荧光强度检测方法(例如荧光板读出器)也将是直截了当的，并不一定需要利用共焦仪器。

发明内容

本发明一方面提供了用于鉴定调节mRNA与靶蛋白质之间相互作用的物质的测定法，所述测定法包括：

a)提供长度至少为100个核苷酸的标记的mRNA，任选作为均质溶液提供，所述的标记为对mRNA环境中的改变敏感的物质；

b)在不存在和存在候选化合物的情况下使靶蛋白质如HuR与步骤a)中提供的mRNA接触，所述候选化合物预期将在所述mRNA与所述靶蛋白质如HuR之间能够形成复合物的足够长的时间内调节所述mRNA与所述靶蛋白质如HuR之间的相互作用；

c)检测步骤b)中形成的复合物；

d)测定在步骤b)中不存在或存在候选化合物的情况下所形成的复合物的量是否存在差异；和

e)将在步骤d)中测定到差异的候选化合物选为鉴定物质。

测定原理可以说明如下(例如，如图1中所示)：标记mRNA，例如，通过肼醛连接化学在3’末端用Cy3标记。一旦靶蛋白质结合至标记的mRNA，则所述标记如Cy3的量子产率改变，例如增加，并且这种改变提供了mRNA与靶蛋白质相互作用的读出值。这一效应显然不涉及蛋白质与标记的直接接触，而且，甚至对于靶蛋白质(如HuR)结合位点远离其3’端标记的mRNA而言，也可观察到再现性。目前我们推断这一结果可能是因为与靶蛋白质形成复合物时，RNA三维构象改变，通过长程效应发生平移所致，并且归因于标记如Cy3的环境敏感性(例如，参见Mujumdar R.B等，Bioconj Chem.1993，4(2)105-11)。因潜在抑制剂所致的蛋白质-mRNA复合物形成的减少将检测为读出值如总荧光强度的下降，或具有更高分子亮度的物质颗粒数量的减少。

在优选的实施方案中，靶蛋白质为HuR蛋白。

mRNA可以为含ARE的mRNA，并且包括：例如炎性靶标，包括来自TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-8、Cox-2、IL-4或AT-R1的ARE，而且包括其他ARE调控的靶标家族。例如，原癌基因，如c-myc、c-jun或c-fos。

在本发明的另一方面，mRNA选自编码IL-2、IL-1β和TNF-α的序列，或这类序列含ARE的片段。

在本发明的另一方面，mRNA具有100-500个核苷酸，优选300个核苷酸的长度。

标记可以为常规的，例如生物素或酶，如碱性磷酸酶(AP)、辣根过氧化物酶(HRP)或过氧化物酶(POD)或荧光分子，例如荧光染料。优选标记为荧光染料，例如Cy3或Cy5，例如Cy3。

在本发明的优选的一方面，标记为荧光标记，例如Cy3或Cy5。

靶蛋白质可以为已知结合mRNA的任何蛋白质，其中这类结合导致RNA三维构象改变。在本发明的另一方面，靶蛋白质为结合含ARE的mRNA的ELAVL1(＝HuR)。