[发明专利]用于在真菌细胞中表达基因的曲霉启动子

说明书

技术领域

本发明涉及DNA序列(特别是经分离的启动子)和DNA构建体、载 体和包含与编码序列可操作连接的这些启动子的宿主细胞。本发明还涉及 用于表达基因和/或制造生物学化合物的方法。

背景技术

在宿主细胞中对重组生物学化合物的生产通常通过构建表达盒完成， 在所述表达盒中，编码生物学化合物的DNA和适用于宿主细胞的启动子 可操作地连接。表达盒可通过质粒介导或载体介导的转化引入宿主细胞。 然后可通过在下述诱导条件下培养经转化的宿主细胞完成对生物学化合物 的制造，所述诱导条件是表达盒中所含启动子适当发挥功能所必需的。

对于每种宿主细胞而言，通过转化被引入宿主细胞的编码序列的表达 和对由该编码序列编码的重组生物学化合物的制造需要功能启动子的可用 性。已知能在多种宿主细胞中发挥作用的大量启动子。真菌宿主细胞中存 在启动子跨物种(cross-species)使用的实例是：Aspergillus nidulans启动子 (A.nidulans gpdA基因已知在Aspergillus niger(A.niger)中发挥作用(J Biotechnol.1991 Jan；17(1)：19-33.Intracellular and extracellular production of proteins in Aspergillus under the control of expression signals of the highly expressed A.nidulans gpdA gene.Punt PJ，Zegers ND，Busscher M，Pouwels PH，van den Hondel CA.)。另一实例为用在A.niger和A.nidulans中的A. niger β-木糖苷酶xlnD启动子，Transcriptional regulation of the xylanolytic enzyme system of Aspergillus，van Peij，NNME，PhD-thesis Landbouwuniversiteit Wageningen，the Netherlands，ISBN 90-5808-154-0和 Escherichia coli β-葡糖醛酸糖苷酶基因在A.niger、A.nidulans和 Cladosporium fulvum中的表达，如Curr Genet.1989 Mar；15(3)：177-80： Roberts IN，Oliver RP，Punt PJ，van den Hondel CA.″Expression of the Escherichia coli beta-glucuronidase gene in industrial and phytopathogenic filamentous fungi″所述。

然而，仍然需要经改进的启动子，用于控制引入的基因的表达、用于 控制内源基因的表达水平、用于控制对内源基因表达的调节或用于介导内 源基因的失活，或用于制造多肽，或用于前述应用的组合。这些经改进的 启动子可例如比先前已知的启动子更强。它们还可被特定的便利的底物或 化合物诱导。当期望在单种宿主细胞中同时过量表达多种基因时，知道若 干功能性启动子也是有利的。为了防止噪音抑制(squelching)(特定专利因 子的效价(titration))，优选使用多种不同的启动子，每个待表达的基因一 个特定的启动子。

附图说明

图1描述了pGBTOPGLA的质粒图谱，其为整合型葡萄糖淀粉酶表达 载体。

图2描述了pGBTOPGLA-2的质粒图谱，其为带有多克隆位点的整合 型葡萄糖淀粉酶表达载体。

图3描述了pGBTOPGLA-6的质粒图谱，其为含有与葡萄糖淀粉酶编 码序列可操作连接的本发明启动子的整合型表达载体。该图还阐释了在这 些实施例中构建的其它五个pGBTOPGLA载体的结构，其为 pGBTOPGLA-8、pGBTOPGLA-11、pGBTOPGLA-12、pGBTOPGLA-13或 pGBTOPGLA-14。

图4描述了通过单同源重组整合的图示。

图5：WT1、WT2和不同pGBTOPGLA载体的转化体的葡萄糖淀粉 酶活性。显示标准化的活性，其中WT1第3天的活性设为100％。

图6描述了pGBDEL-PGGLAA的质粒图谱，其为置换型载体。