[发明专利]Ljungan病毒的检测方法

说明书

本发明涉及一种特异性检测Ljungan病毒(Ljungan virus，LV)的方法。具体而言，本发明涉及一种用实时定量反转录PCR检测LV的方法。本发明还提供了用于实行本发明方法的试剂盒。

LV属于小核糖核酸病毒(Picornavirus)科，因此是一种RNA病毒。LV最初发现于田鼠类(欧鼦(Clethrionomys glareolus))中，并且能在很多动物中引发疾病。在编号为WO 98/11133的国际专利申请中公开了三种分离出的该病毒(87-012，174F和145SL)的分离株以及每种分离株的部分序列。后来又发表了所述三种LV的全序列(Johansson et al.，J.Virol.，76，8920-8930，2002)。

对于LV原型株87-012以及另两种血清相关LV分离株174F和145SL进行的比较性序列分析表明，这些新测定的瑞典LV株的基因组彼此紧密相关，并且具有如下的异常的小核糖核酸病毒样结构(Johansson et al.，2002，同上)：5’UTR-VP0-VP3-VP1-2A1-2A2-2B-2C-3A-3B-3C-3D-3’UTR。

系统发生分析表明所述LV分离株包含一个独特的单源群，这和副肠孤病毒属(Parechovirus)其他种相同，而与小核糖核酸病毒科(Picorna viridae)的其他成员不同(Johansson et al.，2002，同上；Lindberg and Johansson，Virus Res.，85，61-70，2002)。再者，从捕于美国俄勒冈州的另一种田鼠(Microtus montanus)体内分离的另一病毒M1146的全基因组序列表明，这种病毒也是小核糖核酸病毒科的一个成员，它与在瑞典分离到的LV最相近，并且是独特的LV族中的一个新的基因型(Johansson et al.，J.Gen.Virol.，84，837-844，2003)。

发现LV也存在于人体中，并引起多种疾病。在瑞典和北美的田鼠体内发现LV表明LV存在于广大地理范围内的许多田鼠群落中。目前，存在有七种已知的LV，分别为源于瑞典的87-012(NC003976；AF327920)、174F(AF327921)、145SL(AF327922)和342SL(B.Niklasson，未发表的数据)，以及源于美国的M1146(AF538689)、NY64-7855(未发表的数据)NY64-7947(未发表的数据)。括号中显示的是其NCBI基因库(NCBIGenBank)编号或其他来源。

LV的基因组及其编码的多聚蛋白在遗传上表现出一些异常的特征，例如缺少预期的VP0的成熟切割，VP0中具有通常存在于其他小核糖核酸病毒VP1中的保守序列决定子，以及两个无关的2A蛋白--2A1和2A2(Johansson et al.，2002，同上)的聚簇。所述2A1蛋白与心病毒(cardiovirus)，鼻病毒(erbovirus)，猪肠病毒(teschovirus)及口疮病毒(aphthoviruses)的2A蛋白相关，所述2A2蛋白与副肠孤病毒，嵴病毒(kobuviruses)及禽脑脊髓炎病毒(avian encephalomyelitis virus)的2A蛋白相关(Johansson et al.，2002，同上；Lindberg and Johansson，Virus Res.，85，61-70，2002)。

LV的特征在于在其啮齿动物宿主及储存宿主中引起慢性或长期的感染。LV能感染不同种类的动物和人，且其感染可能成为长期或慢性的感染。LV在多种组织培养细胞中进行复制，产生具有分离的致细胞病变效果(CPE)的慢性感染以及低病毒产量(每毫升上清液中1000-100000病毒颗粒的量级)。

实验室条件下的病毒培养获得的数据表明LV可在源自不同组织和不同物种的多种细胞系中生长/复制，例如猴肾Vero细胞；猴肾Vero E6细胞；猴肾MA-104细胞；猴肾CV-1细胞；猴肾GMK细胞；人肺A-549细胞；人子宫颈组织Hela细胞；仓鼠肾BHK21细胞；人肌肉RD细胞；以及鼠皮肤L-细胞。

在动物和人中，LV可在包括心脏组织的肌肉组织，包括大脑的神经细胞，以及包括胰腺β细胞、甲状腺和肾上腺的内分泌腺中进行复制。