[发明专利]对核苷类似物敏感性降低的乙型肝炎病毒变异体及其用途

说明书

本发明涉及对特定药物敏感性降低的乙型肝炎病毒(HBV，也称为HBV病毒)变异体领域。更具体地，本发明涉及诊断HBV样品对用于治疗HBV感染的抗病毒药物的敏感性，涉及一种快速准确检测HBV基因中药物诱导的突变的方法和/或检测方法，以同时表征多个参与耐药性的密码子。

HBV是一种小的包膜DNA病毒，长约3200bp，属于嗜肝DNA病毒家族。在复制策略上，该病毒经RNA中间体通过反转录进行复制(Summers，1982)。HBV基因组比较复杂，含带有重叠开放阅读框(ORFs)的部分双链DNA结构，包括(i)分别编码分泌型e抗原(HBeAg)和核壳体核心蛋白(HBcAg)的preC/C ORF；(ii)编码病毒聚合酶/逆转录酶的P ORF；(iii)分别编码病毒外壳蛋白、大、中、小s抗原(HBsAg)的preSl/preS2/S ORF；及(iv)编码转录反向激活子蛋白、表面、核心、聚合酶和X基因的XORF。

乙型肝炎病毒的基因组具有较大遗传变异性，目前已识别7个HBV基因型(A到G)(Stuyver et al.，2001；Stuyver et al，2000)。病毒可通过感染的血液传播，引起疾病恶化，并可导致急性肝衰竭。虽然多数成年人可不经治疗而抵抗感染，但乙型肝炎可发展为慢性形式。事实上，全世界约4亿人口被HBV慢性感染，约15％到40％慢性HBV携带者可能发展为肝硬化和晚期肝病。不经过治疗，这些患者的预后较差，因此，开发有效的HBV抗病毒治疗是一个非常重要的目标。治疗的主要目标是控制HBV的复制，使肝病症状减轻，从而中断转向肝硬化和肝癌的进程。对那些由于肝细胞损伤而导致患有活动性炎症、丙氨酸氨基转移酶(ALT)升高及HBV DNA水平(病毒复制水平)高于100.000拷贝/ml的患者进行治疗。

目前批准治疗慢性乙型肝炎的药物有α-干扰素及核苷类似物或这些药物的组合。核苷类似物是化学合成的核苷酸，可在病毒复制过程中作为组件而抑制HBV复制。

已表明干扰素(IFN)治疗仅对小部分携带者部分有效(Lok，1994)，而且由于副作用也受到限制。使用IFN-α治疗慢性HBV感染的相对失败要求治疗性药物和制剂的进一步开发。特别是，已表明多种核苷类似物可通过抑制嗜肝DNA病毒的DNA聚合酶/逆转录酶而抑制嗜肝DNA病毒的复制。其中一些化合物由于毒性(洛布卡韦)或缺乏有效性(法昔洛韦)而退出临床使用(De Clercq，1999；Schinazi，1997；Luscombe etal.，1996)。目前，治疗慢性乙型肝炎最成功的核苷类似物毫无疑问是医学批准的3′-硫胞嘧啶核苷的(-)对映体(3TC或拉米夫定))(Jarviset al，1999)。该药具有较强的抗病毒活性，耐受能力强，副作用较小。但长期使用拉米夫定治疗经常会产生病毒耐药性。其中赋予拉米夫定耐药性，并降低病毒的体外复制效率的一个常见突变是HBV RNA依赖的DNA 204位密码子处的甲硫氨酸到异亮氨酸，或甲硫氨酸到缬氨酸替代(Ling R.et al.，1996；Bartholomew M.et al.，1997；Tipples G.A.et al.，1996)。除了在保守的YMDD元件中Met到Val或到Ile的氨基酸替代(rtM204V/I)外，在逆转录酶基因的其它位点的突变基因型模式也与拉米夫定耐药性有关。特别是，已报道聚合酶B结构域的180位密码子亮氨酸到甲硫氨酸的突变(rtL180M)可部分恢复复制适应性，并增强体外耐药性。拉米夫定耐药性在HBV/HIV共感染的患者中比HBV单重感染的患者中更常见，从而必须改变拉米夫定的治疗方案(Benhamou et al.，2001；Benhamou et al.，2003；Benhamou et al.，2004；Dore GJ.et al.，2004)。