[发明专利]反应方法

说明书

本发明涉及用于进行多步反应(例如化学或生化反应，特别是扩增反应，例如聚合酶链反应)的方法，其中实现了后续步骤，例如分析物检测或进一步的扩增，以及涉及可以在这些方法中使用的例如试剂容器和试剂转移装置的元件。

有非常多的其中化学或生物化学测定或反应在多步反应中进行的实例，也即进行第一反应，然后需要添加一种或多种另外试剂来进行第二反应或对第一反应的进行提供指示的意义。特别是在第一反应之后需要从反应容器上除去帽子或盖子来允许添加该一种或多种另外试剂的情况下，所述一种或多种另外试剂的引入会产生污染问题。

扩增反应特别容易引入污染，这是因为需要原料试剂的量非常低。甚至微小痕量的产物(例如前述的扩增产物)会污染，并由此成为其它反应的“引子”。

在需要反应自动进行的情况下，问题会被恶化，这是由于盖子等的除去通常不容易在自动装置中实现。因此，其可能在开口反应容器中进行，因此会保留污染的风险。

最近，开发了一些封闭管测定方法。然而使用这些测定方法，需要扩增和探针在均相系统中。尽管目前这是可行的，但有时会存在优选非均相方法的理由，特别是需要使用的探针会在或大或小程度上抑制该扩增反应的情况下。

本申请人找到了一种进行多步反应的改进方法。

依照本发明的第一方面，提供了进行多步反应的方法，所述方法包括：

1)在反应容器中添加一种或多种第一试剂，所述反应容器包括能够容纳试剂的上部腔室，该上部腔室与限制试剂流的下部腔室连通，

2)使所述反应容器承受离心力，以驱动所述一种或多种第一试剂进入下部腔室中；

3)在该第一腔室添加另外试剂，并关闭所述腔室；

4)使上部腔室或下部腔室其中至少之一经受使所述一种或多种第一试剂或所述另外试剂分别参与第一反应或达到所需反应条件的条件；

5)使所述反应容器承受离心力，以驱动所述另外试剂进入下部腔室中，并使其与下部腔室中的内容物相互作用；

其中至少步骤(2)～(5)是自动进行的。

通过在添加所述另外试剂后关闭反应容器，会有效消除后续外部污染发生的可能性，例如在进行第一反应或达到所需反应条件时。

适宜地，下部腔室包括受限进入管，例如毛细管或其它小管，在通常的环境下试剂不会例如由于表面张力而进入该管。该管在其下端将被封闭。

对于物质在其中加热或冷却的反应，优选该腔室具有高的表面积与体积之比，使可以发生快速热交换，毛细管提供了这种腔室的良好实例。这些管能够用于少量体积流体样品的快速加热或冷却。

因此在特别优选的实施方案中，在步骤(4)中，是下部腔室经受所需的条件。

在上述步骤(3)中，合适地通过适当形状的盖子将反应容器关闭，该盖子可以与反应容器的开口以卡扣配合(snap fit)，或旋入其上部空间，以形成气密性密封。然而，也可以使用其它关闭方法和器具，例如使用密封膜、金属箔或层压的金属膜施加在反应容器的开口上。此外，如下所述，在某些装置中，特别是在其中将样品等自动递送到反应容器中的自动化装置中，可以使用其它部件，例如递送喷嘴、递送棒(例如通过使用磁性珠子和磁性棒实现物质的转移)或刀具或穿刺棒，用作同样用于关闭该反应容器的器具。

该一种或多种第一试剂和该另外试剂可以是只有在经受特定条件时才会一起反应的试剂的组合，该特定条件例如加热和/或冷却或照射，例如UV光照射，其可以在上述步骤(4)中施加。可选择地，该一种或多种第一试剂可以用于在预备步骤中与一种或多种已经分配到下部腔室中的附加试剂进行反应，例如在预备离心步骤中。如果合适，任何预分配的试剂可以在下部腔室中进行冷冻干燥。

然而，所述试剂在步骤(4)的过程中不必参与反应。可能仅需要确保在被混合在一起之前，该一种或多种第一试剂或该另外试剂达到所需的反应条件，例如达到所需的温度，且任选地在该温度下保持适当时间。在这种情况下，在步骤(4)中可以将所需条件应用所需的时间间隔。

该方法可广泛应用于一定范围的反应。例如，其可以用于在其终点处进行询问(interrogated)的聚合酶链反应(PCR)。在这种情况下，该一种或多种第一试剂或该另外试剂，但优选该一种或多种第一试剂包括包含或怀疑包含目标核酸(例如DNA)以及进行PCR所需的试剂，例如引物、缓冲液、镁盐和聚合酶，的样品。