[发明专利]规定部位发光量测定方法、规定部位发光量测定装置、表达量测定方法及测定装置

说明书

技术领域

本发明涉及测定来自活的样本内的规定部位的发光量的规定部位发光量测定方法以及规定部位发光量测定装置。

本发明涉及将导入了解析对象的基因的活细胞作为对象，将荧光测定和发光测定组合起来，辨认细胞周期的阶段并且测定解析对象的基因的表达量的表达量测定方法。

本发明涉及拍摄标本像来观察标本的测定装置，特别涉及适用于被赋予了发出微弱光的发光标识以及被激励而发出荧光的荧光标识的标本的观察的优选的测定装置。

背景技术

[I]ATP是细胞内的能量供给源，是与生命现象密切相关的物质。另一方面，萤的荧光素酶在ATP、O₂、Mg²⁺的存在下，将D-荧光素作为发光基质，催化生成氧化荧光素、CO₂、AMP、焦磷酸的反应，并通过该反应而发光。并且，荧光素酶的发光反应依赖于ATP量。

因此，以往一直利用荧光素酶的发光反应对ATP进行定量，在生物、临床检查、食品卫生等领域中，开发出使用荧光素酶的细胞内的ATP量的测定方法。

例如，细胞内的ATP量的测定通常利用以下的(1-1)～(1-3)的工序来进行。

(1-1)溶解细胞或细菌来提取ATP。

(1-2)在包含荧光素和荧光素酶的反应液中添加该提取液。

(1-3)根据添加了提取液的反应液来测定发光量，从而对细胞内的ATP进行定量。

并且，没有分裂的细胞内的ATP量的测定通常利用以下的(2-1)～(2-3)的工序来进行。

(2-1)在细胞中导入荧光素酶基因来表达。

(2-2)在包含细胞的培养液中加入荧光素。

(2-3)根据加入了荧光素的培养液来测定发光量，从而对细胞内的ATP进行定量。

进而，活细胞内的规定部位(具体而言是线粒体)中的ATP量的经时测定利用以下的(3-1)和(3-2)的工序来进行(非专利文献1)。

(3-1)在荧光素酶基因中融合线粒体转移信号基因，将该融合后的基因导入到细胞。

(3-2)在荧光素酶局部存在于细胞内的线粒体中的前提下，通过经时测定来自细胞的发光量，从而测定细胞内的线粒体中的ATP量的变动。

另外，因为从细胞内发出的发光的强度非常微弱，所以为了识别一个细胞，利用安装了影像增强器的CCD照相机进行光子计数。并且，利用不同于测定了发光量的细胞的其他细胞，来确认荧光素酶是否局部存在于细胞内的线粒体中。具体而言，固定该其他细胞，在固定的细胞中使抗荧光素酶抗体反应，利用荧光抗体法观察细胞，从而确认局部存在。由此，表示来自所测定的细胞的发光量与来自线粒体的发光量对应。

[II]细胞增殖是生物在生命维持中基本且重要的特征之一。而且，细胞周期是由细胞成长、DNA复制、染色体分配以及细胞分裂等构成的多个连续反应，在细胞周期的各个阶段中，充分考虑各种基因的表达的变动。并且，认为细胞周期的异常和失败与许多慢性疾病和癌变有关(参照专利文献1)。另外，专利文献1公开了涉及细胞周期调节因子的活性的测定方法和使用该测定方法的癌症的诊断方法的技术。

但是，在将荧光素酶基因作为报告基因导入到细胞，以荧光素酶活性为指标调查荧光素酶基因的表达强度时，在荧光素酶基因的上游和下游连接目标DNA片段，从而能够调查该DNA片段对荧光素酶基因的转录造成的影响。并且，将被认为对荧光素酶基因的转录造成影响的转录因子等基因连接到表达载体上，与荧光素酶基因一起表达，从而能够调查该基因的基因产物对荧光素酶基因的表达造成的影响。另外，将荧光素酶基因等报告基因导入到细胞的方法，例如有磷酸钙法、阳离子脂质体(1ipofectin)法和电穿孔(electroporation)法等，根据目的和细胞种类的差异，区分使用各个方法。

并且，导入到细胞内并表达的荧光素酶的活性的测定(监视)按照以下步骤进行：首先使溶解了细胞的细胞溶解液与包含荧光素、ATP和镁等在内的基质溶液进行反应，接着，利用使用了光电子增倍管的光度计对来自与基质溶液反应的细胞溶解液的发光量进行定量。即，在溶解细胞后测定发光量。由此，能够将某个时刻的荧光素酶基因的表达量作为细胞整体的平均值来进行测定。