[发明专利]抗体的改良方法

说明书

技术领域

本发明涉及通过人抗体分子的氨基酸置换进行分子修饰，以改善表达量或稳定性等性状的技术。该技术对于在推进使用抗体的研究或开发上的大障碍——生产量低、使用时发生凝聚或改性、失活等，有望成为使它们得到改善的方法。

背景技术

抗体药物是以人所具有的机体防御机能为基础，以特定的功能性分子作为靶的分子靶向治疗药。受到人们很大的关注，特别是在癌症领域和类风湿领域中显示很高的有效性，其有力推动了近年来的世界性开发热潮，世界市场规模持续扩大。

伴随着这样的社会背景，在抗体药物或抗体工程领域中取得了显著的技术进步，但是所获得的抗体分子的克隆常常是由于生产量低或稳定性低等，常常是应用上非常麻烦，解决上述问题并不容易。上述问题在推进使用抗体进行的研究或开发方面遇到的很大的障碍。

抗体药物所遇到的问题有成本问题。治疗时必须有较大量的抗体，另外在制备设备等方面也发生较大投资，不仅患者负担加重，也使国家医疗费用增加。因此，在抗体药物的开发中，实现生产率的提高、降低成本成为大的课题。

生物体内的抗体的序列是由于伴随B细胞成熟而发生的随机的基因重组或突变而产生，并选择其中具有最佳的抗体序列的B细胞进行增殖。其最佳化主要与抗原结合能力有关，除此之外还是结构域的稳定性、H链和L链的相互作用、可变区和恒定区的相互作用、蛋白酶的敏感性、以及细胞的分泌效率等多种因素复杂作用的结果。因此，天然的抗体序列其稳定性未必是最佳。

以分离的抗体克隆作为重组蛋白，使其表达并对其进行分析，也往往是非常不稳定的状态。结果必须面对下述问题：(1)表达量非常低、(2)不是可溶性地表达，而是形成内含体，必须进行重折叠；(3)纯化时暴露在酸中，容易引起变性；或者(4)在室温或4℃下通过静置就会发生沉淀或改性，反应性消失。

作为解决上述问题的对应方法，目的之一是对每一种抗体克隆分别进行操作条件或缓冲液等最佳条件的探讨。但是，该探讨不仅需要很多的劳力和成本，有时也可能无法解决，只好放弃对有希望的具有反应性的抗体克隆进行的分析或开发。

目的之二是如改良抗体，进行氨基酸置换或分子转化等分子修饰。通常，为了提高蛋白质的稳定性而进行的修饰的方法有以下：从具有同源性的其它序列中移植更保守的氨基酸的方法；实施计算机建模，进行合理设计，使分子表面的亲水性提高，或者使疏水性芯的内部的疏水性提高、增加堆积强度等方法(非专利文献1)。

关于通过抗体分子的氨基酸置换提高稳定性或提高表达量，目前的报告例中有很多是对每种抗体克隆的序列进行特征性的氨基酸修饰，可常规化进行的修饰技术的例子尚未出现。可能作为常规化的修饰技术有：Worn等人的报道：对VH进行1或2处的氨基酸置换，由此提高单链抗体(scFv)的稳定性(非专利文献2)；Knappik等人的报道：对VH进行1或多处氨基酸置换，使Fv片段的表达量提高，抑制凝聚反应(非专利文献3)；Steipe等人的报道：对VL进行1或2处的氨基酸置换，提高VL结构域的稳定性(非专利文献4)；Hugo等人的报道：修饰VL的34位(按照Kabatnumbering体系)，从而提高scFv的稳定性和表达量(非专利文献5)，其中作为修饰对象的抗体都是小鼠抗体。

关于抗体药物，如果使用小鼠抗体，由于其高免疫原性，在给予人时被识别为杂质并排除。因此，难以将它们作为疾病的治疗药物使用。作为解决该问题的方法，可以使用蛋白质工程学的方法，将小鼠单克隆抗体进行嵌合化，但是，来自小鼠的序列占三成或以上，因此如果反复给予或长期给予，产生抑制所给予的嵌合抗体活性的抗体，不但其效果显著减弱，并且可能导致严重的副作用。

因此，目前的主流思路是通过构建将小鼠可变区的互补性决定区(CDR)移植到人可变区的人源化抗体、或者具有完全来自人的序列的人抗体来解决上述问题。

Ewert等人报道：以人抗体为对象，对VH进行1或多处氨基酸置换，可以使scFv的稳定性和表达量提高(非专利文献6)。但是，其中作为修饰对象的是VH6家族，属于该家族的基因的使用频率不过1.4-2.4％(非专利文献7)，因此难以说这是可广泛采用的技术。

如上所述，以疾病相关抗原作为靶的特异性抗体在人的诊断或治疗等临床中非常有效，因此人们普遍希望能够确立同时具有高抗原特异性、低免疫原性、以及高生产率的特征的抗体的制备技术。

非专利文献1：Vriend等人，J.Comput.Aided Mol.Des.，7(4)，367-396页(1993)