[发明专利]表达含有二硫键的蛋白质的方法

权利要求书

1.一种在原核宿主细胞内表达真核蛋白的方法，所述真核蛋白要求形成多个 链间或链内二硫键以获得其生物学活性，所述的方法包括：

a)用编码融合蛋白的表达载体转化原核宿主细胞，所述融合蛋白包括编码硫 氧还蛋白的N端片段和编码真核蛋白的C端片段，所述真核蛋白要求形成至少两 个链内或链间二硫键以获得生物学活性；和

b)以生物学活性形式表达融合到所述的硫氧还蛋白的所述的真核蛋白。

2.权利要求1所述的方法，其中所述宿主细胞已被修饰，以在所述细胞的细 胞质中表达二硫键异够酶(DsbC)。

3.权利要求2所述的方法，其中所述DsbC具有SEQ ID NO：3所示的序列。

4.权利要求2所述的方法，其中所述DsbC被修饰，以便其活性位点序列 CGYC已被变为CGFC或CTFC。

5.权利要求1所述的方法，其中所述宿主细胞已被修饰，以在所述细胞质中 表达巯基-二硫键互换蛋白(DsbD)α-结构域片段。

6.权利要求5所述的方法，其中所述DsbDα-结构域具有SEQ ID NO：4所 示的序列。

7.权利要求2所述的方法，其中所述宿主细胞已被修饰，以在所述细胞质中 表达巯基-二硫键互换蛋白(DsbD)α-结构域片段。

8.权利要求7所述的方法，其中所述DsbDα-结构域具有SEQ ID NO：4所 示的序列。

9.权利要求1所述的方法，其中所述融合蛋白的硫氧还蛋白部分来自与所述 原核宿主相同类型的生物体。

10.权利要求1所述的方法，其中所述融合蛋白的硫氧还蛋白部分具有SEQ ID NO：1所示的序列。

11.权利要求1所述的方法，其中所述融合蛋白的硫氧还蛋白部分含有作为 活性位点序列的CPYC。

12.权利要求1所述的方法，其中所述融合蛋白的硫氧还蛋白部分含有作为 活性位点序列的CGPC。

13.权利要求1所述的方法，其中所述宿主缺乏硫氧还蛋白还原酶(trxB)、 谷胱甘肽还原酶(gor)、ompT或lon基因产物中的任何一种或多种。

14.权利要求1所述的方法，其中编码切割位点的序列位于所述编码硫氧还 蛋白的序列和所述编码真核蛋白的序列之间。

15.权利要求14所述的方法，其中所述切割位点容易遭受蛋白质水解。

16.权利要求15所述的方法，其中所述切割位点是TEV切割位点，其具有 选自ENLYFQG或ENLYFQS的序列。

17.权利要求14所述的方法，其中所述切割位点容易遭受化学切割。

18.权利要求17所述的方法，其中所述切割位点序列具有氨基酸序列DP。

19.权利要求1所述的方法，其中所述融合蛋白包括肽序列，所述肽序列是 受体的配体。

20.权利要求19所述的方法，其中所述肽序列包括聚组氨酸序列。

21.权利要求1所述的方法，其中所述宿主是细菌。

22.权利要求21所述的方法，其中所述细菌是大肠杆菌(E.coli)。

23.权利要求22所述的方法，其中所述大肠杆菌是Origami菌株。

24.权利要求1所述的方法，其中所述真核蛋白是解联蛋白。

25.权利要求24所述的方法，其中所述解联蛋白是选自PI、PII或PIII类的 蛇毒素。

26.权利要求24所述的方法，其中所述解联蛋白是contortrostatin。