[发明专利]表达含有二硫键的蛋白质的方法

说明书

政府资助声明

【0001】本发明全部或部分地由美国陆军(the United States Army)和美国国 立卫生研究院(the National Institutes of Health)的资金资助。美国政府可以拥有本 发明的某些权利。

发明背景

【0002】本发明涉及在重组宿主中表达蛋白质的方法，而且更特别地是在微 生物宿主中表达为了维持生物活性所需要形成二硫键的异源真核蛋白质。

【0003】各种蛋白质是已知的，其具有商业和医疗的应用，且其特征在于具 有由二硫键稳定的复杂分子结构。一种这样类别的蛋白质，解联蛋白，包括富含 半胱氨酸的蛋白质种类，其是整合素的已知最有效的可溶性配体(Gould.Polokoff et al.1990；Niewiarowski，McLane et al.1994)。三肽基序RGD(精氨酸-甘氨酸-天 冬氨酸，Arg-Gly-Asp)，在大部分单体解联蛋白中，是保守的(Niewiarowski，McLane et al.1994)。RGD序列在柔性环，即整合素-结合环的端部，其由二硫键稳定并且 从肽链的主体中突出出来。解联蛋白结合到纤维蛋白原受体αIIbβ3，其使得纤维 蛋白原-依赖性的血小板凝聚受到抑制(Savage，Marzec et al.1990)。除了裂解素 (barbourin)，其为含有KGD的解联蛋白，它对于αIIbβ3整合素来说是相对特异 性的配体(Scarborough，Rose et al.1991)，其它解联蛋白是相对非特异性的，而且 能阻断或干扰与其它β3整合素以及β1整合素的功能相关的信号通路(McLane， Marcinkiewicz et al.1998)。

【0004】Contortrostatin(CN)是从亚种南美铜头蝮(Agkistrodon contortrix contortrix)(南铜头蝮)毒液中分离出来的解联蛋白(Trikha，Rote et al.1994)。CN 在其整联蛋白-结合环里，呈现典型的RGD基序。不像其它的单体解联蛋白，CN 是同型二聚体，如质谱所显示，对于完整分子，具有的分子量(molecular mass(Mr)) 为13,505；以及对于还原性链，为6,750(Trikha，Rote et al.1994)。

【0005】迄今所鉴别出的CN受体，包括：整联蛋白α II bβ3、αvβ3、ανβ5和 α5β1(Trikha，De Clerck et al.1994；Trikha，Rote et al.1994；Zhou，Nakada et al.1999； Zhou，Nakada et al.2000)。CN与整联蛋白之间的相互作用全部为RGD-依赖性。 作为抗癌剂，CN已经在体外基于细胞的功能试验和体内动物模型中，显示出其是 高效的抗血管生成和抗转移性分子(Trikha，De Clerck et al.1994；Trikha，Rote et al. 1994；Schmitmeier，Markland et al.2000；Zhou，Hu et al.2000；Markland，Shieh et  al. 2001；Swenson，Costa et al.2004)。CN也具有直接吸引(连接，engage)肿瘤细胞、 并且以细胞抑制的方式(in a cytostatic manner)抑制它们的生长的能力(Trikha，De Clerck et al.1994；Trikha，Rote et al.1994；Schmitmeier，Markland et al.2000)。CN的 抗肿瘤活性基于其与癌细胞和新生血管内皮细胞上的整联蛋白α5β1、αvβ3和αvβ5 具有高的亲和作用(Trikha，De Clerck et al.1994；Zhou，Nakada et al.1999；Zhou， Nakada et al.2000；Zhou，Sherwin et al.2000)。这种多样性的作用机理使得CN具有 比许多抗血管生成试剂显著的优势，这些抗血管生成试剂仅阻断单一抗血管通道 和/或不能直接靶向肿瘤细胞。