[发明专利]无氰化物的溶解剂组合物及其用于血红蛋白和白血球测定的方法

说明书

技术领域

[001]本发明涉及溶解剂组合物及其用于测定血样中的总血红蛋白浓度和白血球的方法。

背景技术

[002]总血红蛋白的测定可以指示全血的载氧能力。通过对具有临床症状的病人的检查和通过临床正常人群的电泳分析调查，发现了超过300种的异常血红蛋白。这些异常血红蛋白中的许多会导致临床病变，其中血红蛋白水平发生改变或血红蛋白结合氧的能力被改变。这些疾病中有镰状细胞贫血、α和β-地中海贫血、以及血红蛋白M。

[003]对血样中的血红蛋白(Hgb)进行测定的能力是诊断分析的基本部分，并且对监控治疗反应也是重要的，这些治疗用于治疗影响血红蛋白的疾病、以及用于治疗对血红蛋白的数量具有不良副作用的其他疾病。

[004]在普通主体的外周血中的白血球包括5种类型，即淋巴细胞、单核细胞、嗜中性白细胞、嗜曙红血球和嗜碱细胞。后三种白血球总起来被称为粒细胞。计算并区分血样中的白血球的不同类型为临床诊断提供了有价值的信息。

[005]白血球的分类和计算最常用也称为手工方法的差异分析方法进行。自动血液分析仪也常用于计算白血球，使用溶解剂以溶解红血球，然后测定残留的白血球。已经开发出更复杂的装置用于计算不同类型的包括单核细胞、淋巴细胞和粒细胞的白血球(差异分析)。理想地，人们希望在单个自动化步骤中能完成多重诊断分析，比如血红蛋白测定和计算白血球的数目、或白血球亚群的差异分析。

[006]在许多用于血红蛋白测定的众所周知的方法中，血液学标准化国际委员会(theInternational Committee for Standardization in Hematology)已将氰化物血红蛋白方法推荐为标准。该方法经Matsubara和Okuzono改进后已宽泛地用于临床实验。在该方法中，用赤血盐将所有形式的红血球的各种血红蛋白形式中血红素基团的铁离子氧化成高铁血红蛋白。然后将高铁血红蛋白与对血红素基团的铁离子具有很高亲合性的氰化物阴离子复合，从而形成氰化高铁血红蛋白色原。该非常稳定的色原在540nm处具有最大吸收峰，可通过分光光度计人工测定。

[007]虽然通过标准的氰化高铁血红蛋白方法和其改进的自动化方法形成了稳定的色原，但试剂废料因氰化钾的使用而导致巨大的环境问题。在过去的二十年中，人们进行了不懈的努力，试图开发出不用氰化物的自动化血红蛋白分析方法。

[008]Oshiro等在文献Clin.Biochem.1583(1982)中公开了一种用于血红蛋白分析的试剂的用途，该试剂包括十二烷基硫酸钠(SLS)和中性pH(7.2)的曲拉通X-100(Triton X-100，非离子表面活性剂)。SLS被用于溶解红血球，人们相信其还产生了在539nm处具有最大吸收峰并在572nm处具有峰肩的SLS-血红蛋白复合体。反应在5～10分钟内完成，于是可定量测定总血红蛋白。然而，如随后在美国专利号5,242,832(Sakata)中所述的，用Oshiro的方法不可能同时分析白血球和进行血红蛋白测定。

[009]美国专利号5,242,832(Sakata)公开了一种无氰化物的溶解试剂，用于计算血样中的白血球和测定血样中的血红蛋白浓度。该溶解试剂包括至少一种为季铵盐的第一表面活性剂、至少一种包括阳离子和两性表面活性剂的第二表面活性剂、和至少一种血红蛋白稳定剂，该稳定剂选自于包括试钛灵(1，2-二羟基苯-3，5-二磺酸钠)、8-羟基喹啉、二吡啶、1-10-菲咯啉、酚类化合物、双酚、吡唑和其衍生物、第二苯基5-吡唑啉酮和其衍生物、苯基3-吡唑啉酮、以及咪唑和其衍生物的组。Sakata指出，只有通过使用至少两种合适的表面活性剂和通过严格控制表面活性剂的浓度才能实现将白血球划分成两个或三个种群，包括淋巴细胞的聚集物、单核细胞、嗜曙红血球和嗜碱细胞的聚集物、以及嗜中性白细胞的聚集物。Sakata还指出，该溶解试剂的pH优选为5.0～8.0。如果pH值为3.0或以下，那么增加了对白血球的破坏，从而使白血球的测定较难，如果pH为9.0或以上，那么血红蛋白的稳定性随时间而降低。

[010]PCT/US95/02897(Kim)公开了一种无氰化物的试剂用于确定全血样中的血红蛋白。试剂包括：选自于由咪唑和其衍生物、N-羟基乙酰胺、H-羟胺、吡啶、恶唑、噻唑、吡唑、嘧啶、嘌呤、喹啉和异喹啉所构成的组的配体；和选自于由十二烷基二甲胺氧化物和辛基苯氧基聚乙氧基乙醇所构成的组、具有较强红细胞溶解能力的表面活性剂。该分析方法较快，不到10秒。然而，试剂仅在极端碱性条件即pH为11～14下进行。此外，如Kim所述，该试剂不能计算白血球或区分白血球亚群。