[发明专利]测量全血中的凝血酶活性

说明书

[0001]本发明涉及测量方法，尤其是体外测量凝血酶活性的时程，即测量样品中的活性凝血酶，特别是当其在由全血组成的凝血样品中发展时。凝血酶活性的测量结果可由图1中描述的所谓“凝血酶生成曲线”表示。

[0002]本发明还涉及能够实现体外测量样品中随时产生的活性凝血酶的方法。还涉及使用所述测量方法对患者情况进行检测或监控，包括对与血液凝结缺乏相关的病理状态进行检测或监控。

[0003]本发明还涉及使用测量方法筛选物质，包括筛选那些能与凝血过程，尤其是凝血酶活性，相互作用的药物。

[0004]血栓形成性疾病，如心肌梗死、中风、肺栓塞以及一些其它疾病在西方社会是造成约一半的所有死亡和残疾的原因。在发展中国家，它们随着发展程度增加。出血性疾病，虽然在数字上重要性较低，也是死亡的重要原因。因此，止血系统的功能过强或不足是极其重要的发病机制。因而，令人惊讶的是缺乏可用的良好临床功能试验。凝血酶在止血和血栓形成性疾病中的作用：

[0005]在止血和血栓形成中凝血酶起着关键作用。在静脉血栓形成性疾病中这一点早已被认识到(1)并且令人信服地被以下事实所证明，即静脉血栓形成的预防和治疗最好通过降低凝血酶活性，或者通过直接抑制(水蛭素，melagastran)或通过减少合成(维生素K拮抗剂)或通过增加衰减(肝素)。在最近十年间，逐渐了解到凝血酶在动脉疾病中与在静脉疾病中一样重要。临床试验已表明维生素K拮抗剂(2)以及肝素(3)降低心肌梗塞的复发率。凝血酶在出血中的作用通过在严重超剂量口服抗凝血药(4)或肝素(5)使凝血酶生成受到严重影响时观察到的出血时间延长说明。同样，血友病也是凝血酶形成系统的疾病(6)。

所有血液成分均参与凝血酶形成：

[0006]现代研究已认识到凝血酶是通过血液和血浆的既有成分的共同作用形成的。红细胞(RBCs)在这方面活性最小，尽管在它们的一小部分中外膜表现出促凝血活性(7)。更重要的是，白细胞具有组织因子活性。正常情况下该活性被加密，但在损伤时通过与血小板相互作用显示出来(8，9)。起主要作用的无疑是血小板和血浆凝血系统。在教科书中仍发现血小板是初期止血和动脉血栓形成的原因，而血浆的凝结用于加固止血栓，并且是静脉血栓的形成机制。该观点源于将血浆和血小板互相分离进行研究这一事实。事实上，血小板与血浆及血液的其它细胞之间的协作在初期和二期止血，以及在动脉和静脉血栓形成中都是必要的。血小板栓的形成在凝血酶生成中起作用，因为血小板聚集体中的间隙形成不受干扰的微环境，凝血酶可在其中形成而不被血流清除。这就是在凝结全血中测量凝血酶生成与生理实际非常相近的原因。

[0007]除形成凝血酶可在其中形成的“海绵”之外，血小板也活跃地促进凝血酶的生成。它们释放因子V并提供凝血酶原转变所必需的前凝血质磷脂表面，也参与导致凝血酶原酶形成的凝血机制中的不同步骤(10)。因而，凝血酶生成的速度和形成的数量依赖于血小板活性涉及的血浆蛋白。特别有趣的是聚合纤维蛋白的作用。血管性血友病因子(vWf)与聚合纤维蛋白相互作用，经历构象变化，该变化使其可与血小板受体GPIb作用，并通过该结合使血小板变成前凝血质(11，12)。这表明形成纤维蛋白凝块不是止血的终末行为，并且栓(或血栓，或血块)中的凝血酶形成是此过程中的关键事件。的确，正如我们将在下面看到的那样，形成的所有凝血酶中＞95％的在凝血已发生后形成，并且这些凝血酶在止血和血栓形成(H&T)过程中是必要的。也许血小板与血浆凝血系统之间密切关系的最好证据是所有“聚集抑制剂”和其它抗血小板因子也抑制富含血小板的血浆(或全血)中凝血酶生成这一事实。这已被阿司匹林(13)、阿昔单抗(14)、MK383(15)和氯吡格雷(16)证明。相反，特别好的抗血小板药物阿司匹林预防静脉血栓形成的事实(17)进一步表明了血小板功能与凝血之间的紧密联系。

[0008]因此，概言之，血块中形成的凝血酶数量是止血和血栓形成过程中的本质特征，并且所有血液成分都参与其形成。

凝血酶生成(TG)作为血栓形成和出血风险的指示：

[0009]TG增加总是表明血栓形成风险，或是由于抗凝血酶缺乏或是由于凝血酶原过剩。此外，在蛋白C途径发生障碍(缺乏蛋白S和C，因子V_Leiden)时，凝血酶生成高于正常情况。血浆凝血也是如此，但如果蛋白C途径被凝血调节蛋白活化就变得特别明显(图1)。由口服避孕药诱导的血栓形成倾向可归因于对活化的蛋白C获得抗性，该抗性引起凝血酶生成增加10％，当加入TM或APC时变得更加明显(18，19)。