[发明专利]抗纤连蛋白ED－B和白细胞介素12的抗体L19的融合蛋白

说明书

本发明涉及通过与靶特异性的特异性结合成员缀合将药物靶向至体内的期望部位。本发明特别涉及用于治疗用途的IL12与抗体分子间的缀合物，所述的治疗用途如抑制病理性的血管生成，包括治疗癌症及其它肿瘤、类风湿关节炎、糖尿病性视网膜病、年龄相关肌肉退化和血管瘤。

异二聚体细胞因子白细胞介素-12(IL12)是先天和细胞免疫的关键介体，具有有效抗癌和抗转移活性[4-6]。它目前(2005年春天)正在用于治疗癌症和传染病的II期的临床试验中测试。IL12主要作用于T和NK细胞，刺激它们的活性和干扰素-γ(IFN-γ)的分泌[7]。然而，正如许多其它的细胞因子相同，重组的人IL12的施用与严重毒性相关，甚至在1μg/kg/天这样低的剂量下[8，9]，阻碍了其作为抗癌药物的研发。

向肿瘤环境靶向递送IL12可以用于提高细胞因子的治疗指数。

Lexigen的科学家已经描述了细胞因子例如IL2和IL12与免疫球蛋白的融合以特异性地靶向细胞因子[17，49-51]。然而，作为本发明的发明人，我们相信这样的途径有局限性。我们意识到IgG-细胞因子融合物实际上是多功能蛋白质，并且因此除了抗原结合和细胞因子活性外，这些基于IgG的融合蛋白质能够激活补体并且与Fc受体相互作用。我们认为，这是IgG-细胞因子融合物的不良特性，因为细胞因子可能被带到携带有Fc受体的细胞(例如巨噬细胞、嗜中性白细胞和天然杀伤细胞)附近，因而阻碍肿瘤靶向并且引起非特异性的细胞活化。我们认为使用缺少Fc的抗体分子会更理想，如使用单链Fv抗体片段(scFv)，而不是全部免疫球蛋白。

我们先前在癌症啮齿动物模型体内已经证明了，通过将连续编码鼠细胞因子IL12(″sclL12″)的p40和p35亚基的单链多肽与人单链Fv抗体片段L19(“scFv(L19)″)融合，能够显著地提高IL12的治疗潜力。已经证明，ScFv(L19)能够在癌症患者体内选择性地肿瘤靶向[16]。L19特异地结合纤连蛋白同种型B-FN1的ED-B结构域，其是一种众所周知的血管生成标记[14，25]。ED-B是在B-FN同种型内发现的91个氨基酸的额外结构域并且在小鼠、大鼠、兔子、狗和人中是相同的。B-FN积聚在攻击性肿瘤和经历血管生成的其它组织内的新生血管性结构，如增生期的子宫内膜和病理状况下的一些眼结构周围，但是在正常的成人组织内未检测到[1-3]。

在小鼠体内，融合蛋白sclL12-scFv(L19)表现出的治疗指数远远高于融合至具有无关特异性的scFv的sclL12，以及重组的鼠IL12。这些实验清楚地证明了基于抗体的细胞因子融合蛋白的潜力是用于改善IL12治疗潜力的途径[15]。这些结果的治疗潜力是相当大的。

由于多种原因，在肿瘤血管水平上IL12的靶向，例如使用L19是有治疗益处的。第一，肿瘤新生血管比肿瘤细胞更易接近静脉给药的治疗剂，这有助于避免与实体肿瘤的隙间高压相关的问题[10]。第二，血管生成(新的微血管从已存在的血管上的生长)是多数攻击性实体肿瘤的特征[11]。将IL12靶向至新生血管应当允许多种不同肿瘤类型的免疫治疗。第三，IL12显示出抗血管生成活性，这是通过它的下游介体IP-10赋予的[12，13]。

我们已经广泛地研究了sclL12-scFv(L19)的肿瘤靶向性能，以及已经融合至另一抗肿瘤细胞因子IL2的scFv(L19)(″scFv(L19)-IL2″)的性能[18]。在带有肿瘤的小鼠体内ScFv(L19)-IL2显示出优异的肿瘤靶向性能，静脉注射后24小时肿瘤∶血液与肿瘤∶器官之比高达30∶1。相反，在相同的动物模型中sclL12-scFv(L19)的肿瘤靶向能力较弱，在24小时时肿瘤∶血液与肿瘤∶器官之比通常比10∶1还差，并且具有较差的肿瘤∶肝脏与肿瘤∶脾之比[15]。不过与融合蛋白sclL12-scFv(HyHEL10)相比，这些靶向结果仍然是优异的，特异于鸡蛋溶菌酶，但在小鼠中缺乏抗原特异性识别。

已经证明了当通过人的IgE的CH4结构域使scFv(L19)二聚化时，构成微抗体结构，也称为″小免疫蛋白″或SIP，scFv(L19)的肿瘤靶向特性得到改善。SIP(L19)的肿瘤靶向特性先前已被描述[21]。

本发明基于这样的工作，作为发明人的我们比较了IL12与scFv(L19)的三种缀合物的肿瘤靶向能力，每种具有不同形式的细胞因子和/或不同形式的抗体，并且发现通过以特殊的方式改变缀合物的形式能够改善sclL12-scFv(L19)的肿瘤靶向能力。