[发明专利]利用HCIC和离子交换层析的蛋白质纯化

说明书

技术领域

本发明一般地涉及利用两步非亲和层析方法并且不使用过程中(in-process)切向流过滤步骤的蛋白质纯化。特别地，本发明涉及一种从包含多肽和一种或多种污染物的组合物中纯化多肽(例如重组蛋白、抗体、抗体片段、Fab和Fv相关产物、单链抗体、双抗体、线性抗体、双特异性抗体、包括来自抗体片段的多特异性抗体、与Fc样区的融合蛋白、抗体样分子，如免疫粘附素)的方法。

背景技术

大规模、经济的蛋白质纯化是生物医药产业上日益重要的问题。治疗性蛋白质典型地利用原核或真核细胞系产生，该细胞系被工程化为由含编码该蛋白质的基因的重组质粒表达目的蛋白质。由于几个原因，从提供给细胞的成分和细胞副产品的混合物中分离出所需蛋白质以达到足够的纯度，如足以用作人类治疗剂的纯度，对于生物制品的制造者来说是一个巨大的挑战。

基于蛋白质的药物产品的生产者必需遵守严格的规章标准，包括极其严格的纯度要求。为确保安全性，管理机构，例如食品和药品管理局(FDA)，要求基于蛋白质的药物产品基本上不含杂质，包括与产品有关的污染物如重组蛋白的聚集体、片段和变体，以及与操作相关的污染物如宿主细胞蛋白质、培养基成分、病毒、DNA和内毒素。尽管有多种蛋白质纯化方案可以应用并被广泛用于生物制药产业，但是这些方案通常包括亲和纯化步骤，例如在抗体的例子中的蛋白A纯化，以达到药学上可接受的纯度。

尽管有先进的层析和过滤方法的出现，为获得治疗级别的纯度，亲和层析仍然经常用作捕获步骤来满足生物医药抗体纯化在纯度、产率、生产能力方面的要求。尽管蛋白A层析对于抗体具有高结合亲和性(对于人IgG来说，大约为10^-8M)，以及具有除去多达99.5％的杂质的能力，但是对于在商业规模上应用于纯化治疗性蛋白质而言，亲和层析是一种昂贵的纯化步骤。不仅蛋白A比非亲和介质显著更贵，还存在其他问题，例如树脂的不稳定性、清洗的困难、配体的渗漏、污染纯化产品的蛋白A或蛋白A相关化合物的潜在免疫原性。然而，亲和介质的高成本和不稳定性提高了基于蛋白质的治疗剂的最终成本，特别是那些需要高剂量和/或长期施用的治疗剂。仅层析就可占下游加工成本的三分之二，对于单克隆抗体来说，亲和捕获柱的树脂的成本可超过原材料的成本(见Rathore等人，Costing Issues in theProduction of Biopharmaceuticals，BioPharm International，Feb 1，2004)。

即使使用蛋白A亲和层析，也经常不能获得足够的纯度，除非结合几种纯化步骤，由此进一步增加了成本并降低了产品的产率。由于抗体占市场上和发展中的治疗癌症、自身免疫病、感染性疾病、心血管疾病和移植排斥的治疗性生物制剂的比例日益增大，需要一种可以利用较少的步骤来纯化蛋白质的方法，由此实现较低的成本。

美国专利公开No.2003/0229212(其全文在此引入作为参考)描述了一种利用非亲和层析纯化步骤紧接着利用高效切向流过滤(HPTFF)步骤从包含宿主细胞蛋白质的混合物中纯化抗体的方法。通过CHOPs(中国仓鼠卵巢细胞蛋白)的减少来确定，该纯化方法导致污染物水平在阳离子交换纯化之后为大约144,780ppm CHOPs，在阴离子交换纯化之后为大约410ppm CHOPs，在HPTFF纯化(最后的步骤)之后大约为17-21ppm CHOPs，因而提供了一种三步非亲和方法。HPTFF的纯化步骤对于获得最终纯度是关键的，其使用带电膜来分离杂质(相对大小不限)，例如蛋白质、DNA和内毒素，并从包含抗体的混合物中清除蛋白质寡聚体和降解产物。

而且，HPTFF存在缺点，即：(1)它是蛋白质治疗剂的发展、优化和放大中的一个额外步骤，需要膜清洗、确认、商业上可以获得的大规模GMP套件(其对于HPTFF仍然是无法获得的)、以及另外的缓冲液、装置和更多的处理时间，和(2)它增加了成本，同时通过损害抗体完整性(通过降解或聚集或其他影响分子活性的分子变化)具有潜在产物损失的危险。

因此，希望可通过一种两步非亲和方法获得高纯度的蛋白质治疗剂，该方法不基于HPTFF，与基于亲和力的纯化方法和其他多步骤纯化方法相比降低成本。如果该非亲和纯化方法可以去除宿主细胞蛋白质、核酸、内毒素、与产品相关的污染物如蛋白质的聚集、氧化、脱酰胺化或降解形式、和培养基添加剂如脂质、维生素、胰岛素、氨甲喋呤、氨基酸、碳源例如葡萄糖等，它将是有益的。