[发明专利]制备和分离磷脂的方法

说明书

发明目的

本发明涉及制备和纯化磷脂酰丝氨酸(PS)的方法以及借助二价金属氧化物(BMO)获得高产率的终产物。

发明领域

大脑老龄化的生理过程中发生的中枢神经系统(CNS)的功能衰退经常导致老年人的认知功能退化，这种退化依次导致行为障碍以及短暂和空间记忆的改变。

CNS活性的功能衰退与神经膜的脂类组分的生物化学和结构变化的开始有关并且与大脑酶的活性降低有关，而这种活性降低可能减少神经元突触。

磷脂酰丝氨酸(PS)是脑中主要的酸性磷脂。因此一段时间以来科学研究集中在发现用于年龄相关的认知障碍的药理学治疗方法，这种方法是基于能阻止(和/或部分重建)老龄化的神经元膜的结构和功能缺陷的磷脂。

人体的临床前和临床研究表明口服施用PS(特别是在老年人中)在学习能力以及短暂和空间记忆方面，甚至是特别的失能病理学(例如阿尔茨海默病)的情况下确定显著增加(Cenacchi T.等人；Aging Clin Exp Res；1993；5：123-133；Nunzi MG等人；Adv Exp Med Biol；1992；318：393-8)。

另外，研究表明磷脂酰丝氨酸能对抗遭受身体紧张的个体的激素皮质醇的增加(Monteleone P.等人；Neuroendocrinology；1990；52(3)：243-8)，从而减少葡萄糖的代谢并且在剧烈的身体努力后获得更大的功能恢复。

本发明涉及PS的合成和纯化方法以及PS作为活性成分在用于预防上述年龄相关病理学的药物(和/或食品补充剂)中和在制备适用于剧烈身体紧张的所有情况的食品补充剂中，以及在制备用于美容领域和/或作为它们包含的药物的控释系统的脂质体中的用途。

科学文献和专利中已知的制备和纯化PS的方法描述了将磷脂酰胆碱(PC)向PS的酶转化，该转化是通过酶磷脂酶D(PLD)催化的转磷脂酰化反应，主要通过有机溶剂对PS的萃取进行随后的纯化。

近年来，多种方法经完善后用于合成PS，这些方法是通过在水/有机溶剂的两相体系或在含水介质中的酶转化实现的。

EP0776976描述了在包含水/甲苯的体系中酶制备PS的方法，其中有机相包含形成PS的起始磷脂，水相包含羟基接受体并且合成反应在粗制磷脂酶D的存在下发生在水/溶剂界面，所述的粗制磷脂酶D是从产生PLD的微生物菌株的发酵培养液中获得的。

1990年，研究者首次尝试避开两相体系，因为两相体系需要大量溶剂，而这些溶剂难以除去，因此导致制备和纯化PS的高成本(Comfurius P.等人，Journal of Lipid Research 1990，31：1719-1721)。

因此，用能将起始磷脂以胶束形式分散的洗涤剂/表面活性剂替代有机溶剂，以便在含水介质中引发独特的合成的酶反应。

事实上，EP1048738涉及在给定浓度的特别的洗涤剂和钙盐的存在下在含水介质中酶合成PS的方法，其中该含水介质通过有机溶剂使其完全没有任何污染。

DE19917249描述了在除了加入氯化钙盐(CaCl₂)不使用表面活性剂的含水介质中酶制备PS的方法，然而，不能确定酶转化百分数以及获得的PS的纯度。

EP1310563公开了在不使用洗涤剂和/或钙盐的水相中制备PS的方法，该方法是基于在水中将包含磷脂、羟基接受体和PLD的起始混合物匀浆，得到与双层磷脂膜结构相似的最终匀浆，其中转磷脂酰化反应可以随后发生。

EP1427839描述了在不包含洗涤剂但存在金属离子的水中酶合成磷脂(包括PS)，所述的金属离子是由配制/溶解在水中的相应盐释放获得。所述的方法发生在两个不同相中，其中从磷脂混合物开始，第一个酶水解反应由PLD催化，产生磷脂酸，随后是第二个转磷脂酰化反应，其中在过量丝氨酸的存在下形成PS。

最后，EP12312134要求了在水中酶合成PS的方法，该方法使用由Streptoverticillium hachijoense菌株产生并且纯化得到的酶PLD的级分，在最终制备PS中获得更高产率。

关于PS(通过在含水介质/有机溶剂或含水介质中的转磷脂酰化获得)的纯化，EP1213294要求了纯化方法，该方法是基于使用包含水/极性溶剂(例如异丙醇)的混合物，以从包含上述磷脂的溶液中萃取磷脂，该溶液依次用烃溶剂(例如甲苯)表示，而EP0922707涉及使用有机溶剂二相体系(例如庚烷和甲醇)从磷脂混合物中萃取/纯化PS的方法。