[发明专利]来自原核细胞的重组N－糖基化蛋白

权利要求书

1.一种生产N一连接的糖基化蛋白的方法，包括：

a)提供用于编码至少一种重组目标蛋白的核酸；

b)向a)中所述的核酸中引入编码一个或一个以上如下N- 糖基化优化氨基酸共有序列的核酸：

D/E-X-N-Z-S/T

其中X和Z可以是除了脯氨酸之外的任意天然氨基酸；

c)提供一种重组生物体，包括用于编码下列物质的核酸：

(i)一种来自弯曲杆菌的功能性pgl操作子，和

(ii)至少一个步骤b)所得核酸编码的重组目标蛋白质， 和

d)以适合目标蛋白质生产和N-糖基化的方式培养重组生物 体。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，用于编码至少一个步骤 c)(ii)所述重组目标蛋白的核酸能够编码至少2种所述 N-糖基化优化的氨基酸共有序列。

3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述重组目标蛋白的核 酸能够编码至少3种所述N-糖基化优化的氨基酸共有序列.

4.根据权利要求2所述的方法，其中，所述重组目标蛋白的核 酸能够编码至少5种所述N-糖基化优化的氨基酸共有序列.

5.根据权利要求1所述的方法，其中，产生的N-连接的糖基化 目标蛋白包括一种或一种以上N-聚糖，所述N-聚糖选 自(i)弯曲杆菌N-聚糖，(ii)衍生自转移到革兰氏阴性 细菌中的O抗原的寡糖和聚糖的N-聚糖和(iii)衍生自转 移到在革兰氏阳性细菌中形成荚膜多糖的O抗原的寡糖和 聚糖的N-聚糖。

6.根据权利要求1所述的方法，其中，产生的N-连接的糖基化 目标蛋白包括两种或两种以上不同的N-聚糖。

7.根据权利要求1所述的方法，其中，产生的N-连接的糖基化 目标蛋白衍生自哺乳动物、细菌、病毒、真菌或植物蛋白。

8.根据权利要求1所述的方法，其中用于编码步骤c)(ii)所 述重组目标蛋白的核酸进一步能够编码至少一种多肽序列， 所述多肽序列能够将所述重组蛋白靶向到革兰氏阴性细菌 的外膜上。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述能够将所述重组蛋白 靶向到革兰氏阴性细菌外膜上的序列选自II型信号肽或外 膜蛋白。

10.根据权利要求1所述的方法，其中重组生物体选自细菌所组 成的组，所述细菌选自由埃希氏杆菌属、弯曲杆菌属细菌、 沙门氏菌、志贺氏菌属、幽门螺杆菌、假单胞菌属和杆菌属 所组成的组。

11.根据权利要求1所述的方法，其中所述重组生物体是重组革 兰氏阴性细菌，所述细菌包括：

i)一种基因型包括编码

a)至少一种天然的或重组特异性糖基化转移酶，用 于在脂质载体上组装寡糖，

b)至少一种来自弯曲杆菌的天然的或重组寡糖转移 酶(OTase)，

c)至少一种权利要求1步骤b)所得的重组蛋白， 和

ii)一种表现型，包括一种重组的N-糖基化蛋白质，该蛋 白质位于革兰氏阴性细菌的外膜内和/或外膜上。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述重组革兰氏阴性细 菌选自：埃希氏杆菌属、弯曲杆菌属细菌、志贺氏菌属、幽 门螺杆菌、假单胞菌属、和沙门氏菌。

13.根据权利要求1所述的方法，其中来自弯曲杆菌的功能性pgl 操作子包括一种核酸，所述核酸编码：

i)来自弯曲杆菌的重组OTase；和

ii)来自弯曲杆菌的重组和/或天然特异性糖基化转移酶；和 /或

iii)来自除了弯曲杆菌之外的菌种的重组的和/或天然的特异 性糖基化转移酶，

用于在脂质载体上组装一种寡糖，所述转移酶被OTase转移 到目标蛋白上。