[发明专利]来自原核细胞的重组N－糖基化蛋白

说明书

本发明涉及N-糖基化蛋白的重组，包括一种或一种以上引 入的N-糖基化优化氨基酸共有序列、编码这些蛋白的核酸和相 应的载体和宿主细胞。另外，本发明介绍了所述蛋白、核酸、载 体和宿主细胞在制备药物过程中的应用。而且，本发明提供了制 备所述蛋白的方法。

背景技术

N-连接的蛋白质糖基化作用是真核生物内质网上发生的一 种基本的且保守的过程。这一过程对于蛋白质折叠、低聚反应、 稳定性、质量控制、分类和分泌物及膜蛋白的传递十分重要 (Helenius，A.，and Aebi，M.(2004)。N-连接的聚糖在内质网中的 作用Annu.Rev.Biochem.73，1019-1049).

蛋白质糖基化作用对蛋白质的抗原性、稳定性和半衰期具有 明显的影响。另外，糖基化作用可以通过色谱法，例如通过结合 在固相上的外源凝集素配体与蛋白质糖基化部分的相互作用帮 助蛋白质纯化。因此，已经有完整的实施方法在真核细胞中重组 生产糖基化的蛋白质，从而提供生物学上和药学上有效的糖基化 模式。

近几年，有研究指出，一种细菌，食物传播病原菌空肠弯曲 杆菌可以N-糖基化其蛋白质(参见Szymanski，等人1999年所 著的文献《空肠弯曲杆菌中普通蛋白糖基化作用的证据》发表于 MoI.Microbiol.32，1022-1030)。糖基化作用所需的机理被聚集在 所谓PgI区域的12个基因编码。N-糖基化作用的破坏影响空 肠弯曲杆菌的侵入和发病机理，但在大多数真核生物中这并不是 致命的(参见Burda P.和M.Aebi，1999年发表的文献《N-糖基 化作用的长醇途径》Biochim Biophys Acta 1426(2)：239-57)。可以 通过在大肠杆菌中同时重组表达pgI区域和受体糖蛋白来重新组 成空肠弯曲杆菌蛋白的N-糖基化作用(Wacker等人2002年发 表的文献《空肠弯曲杆菌中N-连接的糖基化作用机其向大肠杆 菌中的功能性转移》Science 298，1790-1793)。

欧洲专利申请第03 702 276.1号(欧洲专利1 481 057)，是本 发明发明人的一个早期的发明，它教导了一种原核生物体，向此 原核生物体引入一种核酸，来编码(i)为了在脂质体载体中组成 低聚糖的具体的糖基化转移酶，(ii)一种包括共有序列″N-X- S/T″的重组靶向蛋白质，其中X可以是除脯氨酸之外的任何一种 氨基酸，和(iii)一种空肠弯曲杆菌的低聚糖基转移酶(OTase) 这种转移酶将所述低聚糖共价连接到靶向蛋白质的共有序列上。 所述原核生物体产生具有特异性结构的N-聚糖，这种特异性结 构是由具体的糖基化转移酶的种类所决定的。

即使在蛋白质中存在的已知的N-糖基化共有序列允许靶向 蛋白质，包括空肠弯曲杆菌的低聚糖基转移酶(OTase)，在原核 生物体中进行N-糖基化重组，但是这些靶向蛋白质的N-糖基化 作用往往效率较低。

本发明的目的是提供蛋白和生产这种具有优化的N-糖基 化作用的蛋白的方法和途径，所述N-糖基化作用可以在原核生 物体内产生。本发明的另一个目的是在重组蛋白中更有效的引入 N-聚糖，从而修饰重组蛋白的抗原性、稳定性、生物活性、预 防和/或治疗活性。本发明进一步的目的在于提供一种宿主细胞， 所述宿主细胞能够在其表面有效展示本发明的重组N-糖基化 蛋白。

在本发明的第一方面，本发明提供了一种重组N-糖基化蛋 白，所述N-糖基化蛋白包括一种或一种以上的以下N-糖基 化优化的氨基酸序列：

D/E-X-N-Z-S/T，(优化的共有序列)

其中，X和Z可以是除了脯氨酸之外的任意天然氨基酸，其 中向至少一种中引入所述局部N-糖基化的氨基酸序列。

令人吃惊的发现，向蛋白质中引入指定的部分氨基酸序列 (优化的共有序列)能够得到一种蛋白质，这种蛋白质通过低聚 糖基转移酶(OST，OTase)在引入位点进行有效地N-糖基化，其 中所述低聚糖基转移酶(OST，OTase)来自弯曲杆菌属细菌，优 选空肠弯曲杆菌。