[发明专利]连接效应分子与蛋白质的方法

说明书

本发明涉及连接效应分子与蛋白质的方法，且更具体地说，提供了一个或多个效应分子与蛋白质中一个或多个半胱氨酸的位点特异性连接的改进的方法。

带有连接的效应分子的蛋白质用于许多不同目的，既包括诊断应用，又包括治疗应用。例如，抗体可变区的高度特异性和亲和力使得它们成为理想的诊断和治疗剂，特别是用于调节蛋白质：蛋白质相互作用。在Fv、Fab、Fab′、F(ab)₂和其它抗体片段中编码的靶向功能可以与一个或多个效应分子，诸如细胞毒性药物、毒素或聚合物分子结合以便增加功效。例如，由于这些片段缺乏Fc区，所以它们在动物中具有短的循环半衰期，而这一情况可以通过结合某些类型的聚合物，诸如聚乙二醇(PEG)得以改善。已经证实增加结合的PEG的大小使循环半衰期从数分钟增加到多个小时并且已经证实了使用5kDa-100kDa的PEG修饰Fab′(Chapman等，1999，Nature Biotechnology，17，780-783；Leong等，2001，Cytokine，16，106-119；Chapman，2002，Advanced Drug Delivery Reviews，54，531-545)。聚乙二醇化的抗体片段，诸如CDP870目前正在进行临床试验，其中结合的PEG的作用使得循环半衰期对治疗而言达到了可接受的水平。

效应分子可以通过在蛋白质中天然存在的或通过蛋白质工程经人工引入的蛋白质中的反应基团与蛋白质连接。这类基团包括胺类(赖氨酸)、硫醇类(半胱氨酸、甲硫氨酸)、酚类(酪氨酸)、羧酸类(天冬氨酸、谷氨酸)或其它氨基酸侧链。效应分子的连接位点可以是随机的或位点特异性的，不过，通常优选位点特异性连接。

来自含硫的氨基酸半胱氨酸的巯基残基为常用的可以用于选择性偶联效应分子与蛋白质的反应基团。例如，效应分子与抗体的位点特异性连接最常见的是通过连接半胱氨酸残基实现的，因为这类残基在抗体片段中相对不常见。抗体铰链区为位点特异性连接的普通区，因为它们包含半胱氨酸残基并且远离可能参与抗原结合的抗体的其它区。合适的铰链区天然存在于片段中或可以使用重组DNA技术生成(例如，参见US5,677,425；WO98/25971；Leong等，2001 Cytokine，16，106-119；Chapman等，1999 Nature Biotechnology，17，780-783)。或者可以将位点特异性半胱氨酸改造进入抗体片段，以例如，形成表面暴露的半胱氨酸(US5,219,996)。

如果效应分子通过半胱氨酸进行位点特异性连接，那么蛋白质中的靶巯基通常被小的发酵相关肽产物，诸如谷胱甘肽封端或有意地被蛋白质(例如抗体片段)提取和纯化过程中的化学添加剂，诸如5，5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)封端。需要除去这些封端剂以便在连接效应分子前活化靶巯基。在许多情况中，需要选择性活化一个或多个靶半胱氨酸，以便在不还原蛋白质中其它半胱氨酸的情况下进行效应分子连接。例如，抗体Fab′片段在重链与轻链恒定区(C_H1与C_L)之间具有天然链间二硫键，且由此以便选择性还原抗体中的另外处，例如铰链区的靶半胱氨酸，还原必须在一定谨慎条件下进行，使得C_L:C_H1间二硫键保持完整并且避免效应分子与链间半胱氨酸连接。因此，“适度”还原条件常用于除去巯基封端剂并且在与效应分子反应前活化靶巯基。这种适度还原通常通过孵育抗体片段与基于巯基的还原剂，诸如β-巯基乙醇(β-ME)、β-巯基乙胺(β-MA)或二硫苏糖醇(DTT)实现(例如，参见EP0948544)。在还原并且与效应分子(在这些条件下)反应后，大比例的抗体片段不具有任何连接的效应分子并且必须从具有正确数量的连接的效应分子的抗体片段中纯化出它们。这种低效率的效应分子连接在重要的是实现最高生产效率的修饰治疗抗体片段的大规模生产过程中可能是一个缺陷。

本发明提供了选择性连接一个或多个效应分子与蛋白质中一个或多个半胱氨酸的改进的方法。在本发明的方法中，与现有技术的方法相比，较大比例的蛋白质得以正确修饰，从而显著提高了效应分子的连接效率。

因此，本发明提供了连接一个或多个效应分子与蛋白质中一个或多个半胱氨酸的方法，包括：

a)通过对不能形成分子内二硫键的单巯基还原剂或多巯基还原剂渗滤蛋白质来活化蛋白质中的一个或多个半胱氨酸；和

b)使处理的蛋白质与效应分子反应。