[发明专利]用于RNA干扰的寡核苷酸及其生物学应用

说明书

技术领域

本发明涉及对RNA干扰有用的新的双链寡核苷酸(dsON)，还涉及将它们应用于递送寡核苷酸到培养的真核细胞或动物进行生物学和治疗性应用。

背景技术

RNA干扰(RNAi)是现在在早期基因功能水平即mRNA水平上进行基因沉默的技术(Fire et al，1999；Tuschl et al.1999)。该技术提供序列特异性的mRNA降解和蛋白质生成抑制(Yang et al，2000，Zamore et al，2000，Hammond et al，2000，Parrish 2000)。RNAi是高效的，因为其是可预先设计的有活性的dsRNA(siRNA，用于小的干扰RNA)和靶向mRNA。当siRNA双链通过用载体转染并被递送到细胞质时，RNAi在多种哺乳细胞中显示出有效地沉默内源性和外源性基因(Elbashir et al，2001)。

介导RNAi所需的传统dsRNA的结构特征表明优选具有19-25个核苷酸(参见专利WO 0244321，WO 01/075164 A3，EP20010985833)，特别是19-23个核苷酸长度的短dsRNA在哺乳细胞培养系统中有RNAi活性(Parrishb et al.2000；Elbashir et al.2001；Tuschl，2001)。短的19-25个核苷酸(当碱基配对并且带有未配对的3’突出端)担当着指导序列特异性mRNA降解的作用。当两端均是平末端(0个核苷酸突出端)或当1条链是平末端时，有可能观察到RNAi。即使siRNA未配对的突出端的序列对靶目标RNA的裂解不是关键的，但3’突出端的存在对优化RNAi和siRNA的稳定性显示出关键性。优选地，至少一条链具有1-5个核苷酸的3’突出端，特别是1-3个核苷酸的3’突出端。该RNA链优选具有3’-羟基基团和优选在5’末端包含磷酸基团，没有5’突出端。最有效的短dsRNA包含配对的各有21个核苷酸的2条链，这样使1-3个，特别是2核苷酸的3’突出端呈现在dsRNA的两个末端(Elbashir et al.2001)。RNA双链的长度显示出可以被延长到27-28聚体(Siolas et al.2005；Kim et al.2005)，且可以耐受多种化学和/或骨架修饰(Kurreck，2003)。

RNAi的成功依赖于两点：双链RNA的长度、序列、化学结构以及细胞递送的载体。与反义核苷酸或核酶技术相比较，靶mRNA的二级结构对于siRNA进行基因沉默不是一个很强的限制因素。对于给定的mRNA靶，多种siRNA序列可能是有效的。因而，siRNA双链的稳定性和生物学利用度以及递送到细胞中的dsRNA数量依然是有效沉默的限制因素，而不是siRNA对靶的易接近性。

本发明人已发现：当使用相同的递送系统进行导入时，和传统的短dsRNA获得的结果相比较，具有能使双链寡核苷酸互相粘合的特定结构特征的dsON在真核细胞中具有高的RNA干扰活性和能够提供更高的基因沉默效率。由于能够更好地耐受降解，更长的寡核苷酸比传统的短dsRNA展示更高的稳定性。

发明内容

本发明的一个目标就是提供新的组合物，该组合物包含dsON，当被导入到哺乳细胞中时所述dsON是RNAi的序列特异的介导者。进而本发明描述了dsON进行基因沉默的好处，该dsON包含能介导1个或多个靶基因的序列特异性RNA干扰的多个拷贝的短dsON。

本发明还涉及基于合成载体的多种转染递送系统以及它们在生物学上的应用。

本发明的组合物包含具有序列或长度相同或不同的双链寡核苷酸，所述寡核苷酸具有序列³′N₁N₂...N_i-1M_i...N_j⁵′，

其中-³′N_i...N_j⁵′是19-28聚体的双链寡核苷酸序列的一半，其互补于存在于活细胞中的靶核苷酸序列，和

-³′N₁...N_i-1⁵′是3-50聚体的突出端序列，其允许所述双链寡核苷酸寡聚化。