[发明专利]编码类异戊烯修饰酶的多核苷酸和其使用方法

说明书

交叉参考

本申请要求2005年7月5日提交的美国临时专利申请60/697,067的优先权，将 该申请的全文纳入本文作参考。

发明领域

本发明涉及类异戊烯(isoprenoid)化合物生产领域，具体是修饰类异戊烯化合物 的酶。

发明背景

类异戊烯构成了极大并且多样的一类天然产物，它们具有相同的生物合成来源， 即一种代谢前体二磷酸异戊-1-烯酯(isopentenyl diphosphate，IPP)。已经描述了至少 20,000种类异戊烯。由定义可以看出，类异戊烯由所谓的异戊烯(isoprene)(C5)单元组 成。类异戊烯中存在的C原子的数量一般可被5除尽(C5、C10、C15、C20、C25、 C30和C40)，但也报道了不规则的类异戊烯和多萜。类异戊烯化合物也称为“萜” 或“类萜”。类异戊烯的重要成员包括类胡萝卜素、倍半萜类、双萜类和半萜。类 胡萝卜素包括例如：番茄红素，β-胡萝卜素等许多用作抗氧化剂的物质。倍半萜类包 括例如：一种具有抗疟活性的化合物青蒿素。双萜类包括例如：一种癌症化疗药紫 杉醇。

类异戊烯包括许多结构各异的天然产物家族。在这个家族中，分离自植物和其 它天然来源的萜类化合物用作商业性调味剂和香料化合物，以及药物化合物如抗疟 药、抗病毒药和抗癌药。目前使用的大多数萜类化合物是天然产物或其衍生物。许 多这些天然产物的来源生物体(如树、海洋无脊椎动物)既不适合生产商业上可行量所 需的大规模培育，也不适合遗传操作以提高这些化合物的产量或衍生这些化合物。 因此，必须由类似物半合成地产生，或用常规化学合成方法合成这些天然产物。而 且，许多天然产物具有复杂结构，因此，目前合成这些天然产物不具经济性或不可 能合成。这些天然产物必须由天然来源如树、海绵、珊瑚和海洋微生物提取；或由 较丰富的前体合成或半合成地产生。由天然来源提取天然产物受限于天然来源的可 用性；合成或半合成地生产天然产物可能遇到低产率和/或高成本的困扰。这些生产 问题和天然来源的局限性可限制这种产物的商业和临床开发。

倍半萜化合物的一个重要例子是青蒿素。青蒿素是非常有效的抗疟药，目前提 取自植物(黄花蒿(Artemisia annua))，用于联合治疗药物疗法。植物衍生的青蒿素昂 贵，并且其可获得性收到栽培这种植物的国家的天气和政治环境的影响。青蒿酸 (artemisinic acid)是青蒿素生物合成中的关键中间体。通过传统化学方法将紫穗槐 -4，11-二烯转化为青蒿醇是青蒿素制备中的重要步骤，该步骤难以进行并且成本高。

本领域需要能避免一部分上述缺点的产生类异戊烯化合物的方法。本发明通过 提供编码修饰类异戊烯化合物的酶的多核苷酸和经遗传修饰能生产这种酶的宿主细 胞满足了这种需求。

文献

Bertea等(2005)Planta Med.71：40-47；deKraker等(2003)Tetradedron 59：409-418；Martin等(2003)Nat.Biotechnol.21：796-802；WO 03/025193；美国专利 公开号20050019882；美国专利公开号20030148479；美国专利公开号20040005678； 美国专利公开号20030166255。

发明概述

本发明提供了包含编码类异戊烯修饰酶的核苷酸序列的分离核酸，以及含有该 核酸的重组载体。本发明还提供了包含本发明核酸或重组载体的遗传修饰的宿主细 胞。本发明还提供了包含本发明核酸的转基因植物。本发明还提供了生产类异戊烯 化合物的方法，所述方法通常包括在能够合成本发明核酸编码的酶的条件下培养本 发明遗传修饰的宿主细胞，该酶能修饰类异戊烯化合物。

附图简要说明

图1描述了CYP71D-A4cDNA编码序列的核苷酸序列(SEQ ID NO：1)。

图2描述了紫穗槐二烯12-氧化酶氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。

图3描述了黄花蒿细胞色素P450还原酶cDNA编码区的核苷酸序列(SEQ ID NO：3)。

图4描述了黄花蒿细胞色素P450还原酶氨基酸序列(SEQ ID NO：4)。