[发明专利]荧光纳米显微方法

权利要求书

1.一种对染色物体进行纳米显微的方法，所述物体被放置在溶液中或作为保存样本的切片被放置在聚合物上，所述方法采用荧光显微镜，其装有具有抑制滤色器的数字摄像机，用于吸取物体的荧光，所述摄像机能够(以低噪声级)检测由激光激发的各个荧光分子的图像，显微镜还装有用于记录从摄像机接收到的图像的计算机；其特征在于，1-2千不发荧光的染料分子通过UV闪光周期性地被转化成发荧光的染料分子，这些分子覆盖物体结构，所述分子被转化成发荧光的分子是因为阻碍荧光的化学基团与它们分离，所形成的荧光分子的图像在摄像机帧上作为单个点得到检测，所述分子在检测的过程中释放颜色并且具有剩余荧光的帧被从包含荧光颗粒和剩余荧光混合物的帧中减去，被减去的帧保存在计算机存储器内以发现代表染料分子坐标的点的中心，这一过程被重复多次以计算在物体光照区域中所有染料分子的坐标并以大于20-50纳米的分辨率重建物体的2-D或3-D图像。

2.如权利要求1所述的纳米显微方法，其特征在于，利用单个观测的荧光纳米颗粒代替荧光分子对规则形成并脱色的物体进行染色，这些纳米颗粒各自包含多个耐荧光分子，由于布朗力这些分子可以在物体结构之间移动并且在由2-D电泳驱动时，激光持续激发这些颗粒的荧光，摄像机和计算机检测上万个帧，每帧上具有1-2千单独检测的点，这些点反射颗粒位置，根据计算的所有帧上点中心的坐标检测区域的液体部分并且颗粒可以在这些区域中移动。

3.如权利要求1所述的纳米显微方法，其特征在于，采用第二摄像机，第二摄像机与第一摄像机相同，但其定位成使得其传感器检测深度与由第一摄像机检测的平面不同的物体平面的图像，这一差值可以从50纳米到2000纳米，通过两个摄像机接收的光强度分布的差异被用于计算物体中染料分子位置的第三坐标，其被用于形成物体的3-D图像，液体样本中的物体在与总的内部反射角相等的角度下通过物镜得到照射，厚度为不足一微米到几微米的固体切片中的物体可以在固体切片的全部深度上通过物镜或者在总的内部反射角下通过物镜得到照射。

4.如权利要求1所述的纳米显微方法，其特征在于，利用不同染料、不同波长的荧光、一组分色镜对物体的不同结构同时染色，并且滤色器被用于选择性地将不同结构的图像投射在两个或多个摄像机上，这样使同时得到检测的分子的数量倍增。

5.如权利要求1所述的纳米显微方法，其特征在于，除了根据权利要求1-4所述的方法形成的图像，不同的装入分子可以周期性地引入物体，这些分子可以因不同的化学反应或者由于不同的物理过程而由不发荧光变为发荧光，这些因素使阻碍荧光的化学基团分离，以所有产生的荧光分子在摄像机帧上作为单个点得到检测的速度使基团分离，在记录过程中分子释放颜色，具有剩余荧光的帧被从包含剩余荧光图像和荧光分子图像的混合物的帧中减去，减去的帧保存在计算机存储器内以进一步发现点的中心，这些中心代表染料分子的坐标，通过在光照区域形成新的荧光分子以计算物体中所有染料分子的坐标并完成这些“特殊”分子在早期接收到的物体2-D或3-D图形上的计算机位置重建，多次重复上述循环。