[发明专利]荧光纳米显微方法

说明书

技术领域

本发明涉及科研设备，尤其涉及透镜荧光显微镜。这种显微镜被用于获取玻璃荧光物体的图像。更具体地，本发明是一种以达到几纳米(nm)的分辨率重建物体图像的计算机化荧光显微方法。

背景技术

已知的光学显微镜可以利用物镜形成放大的物体图像，所述物镜仅在物体上的两个点之间的距离大于通常所称的衍射极限时才可以分别显示它们。该极限可以采用以下公式进行计算：r＝0.61λ/A(1)，式中λ-通过孔径为A＝n*sin(φ)的物镜聚集的光的波长，n-物体点周围的物质的折射率，φ-在物镜轴线与落入物镜内并在检测器中发现的极端射线之间的角度。现在采用不同类型的设备通过物镜进行荧光显微。大功率弧光灯、白炽灯、激光或日光可以作为显微镜的光源。荧光产生于光照区域中存在的所有染料分子。采用分光分色镜通过物镜使所述区域得到光照。所述分色镜使射出的光落在物体上并将荧光反射到检测器。第二种类型的光照通过从侧面发送激光来产生。这样以总的内部反射角向下或穿过物镜一直到照射物体。在这种情况下，光仅达到距玻璃与折射率低于玻璃的物体之间的边界0.3倍波长的深度。物体荧光由物镜聚集。其发送可以目测并通过光电倍增器、摄影带或数字摄像机记录的物体图像。所有现有的透镜显微镜的主要缺陷是它们具有区分相邻两点的极限。这一极限可以根据公式(1)进行计算。

近年来已经研发了采用由银盐胶片(silver film)制成的超透镜进行显微。胶片厚度小于50纳米；可以确保两个点的分辨率距离相互大致为50纳米。(N.Fang and X.Zhang，Imaging properties of ametamaterial superlens(元物质超透镜的成像特性)，2003，App physLet v.82，2，161-163；Nicholas Fang，Zhaowei Liu，Ta-Jen Yen，andXiang Zhang Regenerating evanescent waves from a silver superlens(来自银盐超透镜的再生损耗波)，2003，OPTICS EXPRESS，Vol.11，No.7，682-687)。然而在生物体上采用这些显微镜还不是很清楚。当前显微镜的分辨率比该设备的分辨率低几倍。

存在着最大分辨率大于例如1纳米的设备，电子、隧道和原子力显微镜。应该注意到它们不仅具有真实的优点，而且具有严重的缺陷，例如：它们的设计和对物体的操作复杂而且昂贵；缺乏接收彩色图像以区别不同类型分子的能力；物体通常必须得到干燥并利用改变物体不同部分相互排列的物质进行处理。原子力和隧道显微镜还不能检测物体内的结构；一次只能检测一个点并且扫描速度不超过每分钟1平方微米；针的末端很容易变脏并且此后不能达到物体表面。

还有一种设备，其中通过激光穿过玻璃纤维粗端上的孔发射物体荧光。通过驱动装置使纤维在三个方向移动以使纤维末端定位在光反射、光漫射或涂有荧光的分子表面附近。这种类型的显微镜不采用透镜并且可以获得分辨率比普通光学显微镜大十倍的图像。仅当玻璃纤维粗端上的孔直径小于光的波长时才能实现这样的结果。光在物体上达到的深度比光的波长小得多。实际上，所有的光回到玻璃纤维内，除了物体从孔的外部收集的那部分。通过光电倍增器测定物体在孔附近收集的荧光、光漫射和反射光强度。通过计算机采集有关测定光的强度的信息以及有关玻璃纤维末端坐标的数据来重建物体表面的图像。这一系统的主要缺陷是：需要采用昂贵的高精度和快速作用的机械单元，其负责相对物体移动玻璃纤维；制造端孔直径小于50纳米的玻璃纤维非常昂贵、复杂和难以复制；孔很容易变脏并在此后不能达到物体表面；仅有很少一部分光可以穿过直径小于光波长的孔离开纤维；如果光比玻璃纤维末端更强，则所述末端会变热并受到破坏；不能对玻璃纤维接触不到的物体区域上的荧光进行检测；一次只能检测一个点，表面扫描速度不超过每分钟1平方微米。