[发明专利]基因载体

说明书

发明领域

本发明涉及用于基因转移和治疗应用的基因载体，并且涉及用于制备它们的方法及其用途。

发明背景

慢病毒载体(LVs)和其它病毒载体是用于基因治疗的有吸引力的工具(Thomas et al.，2003)。LVs可以转导广泛的组织，包括非分裂细胞，如肝细胞、神经元和造血干细胞。此外，LVs整合到靶细胞基因组中，并且提供长期的转基因表达。

尽管LVs可以提供有效和稳定的基因转移，将表达靶定于特定细胞类型，或从特定细胞类型解除表达的靶定，仍然是困难的。在体内施用载体后，该问题特别相关，其中转基因表达可能仅仅在特定细胞群，如肿瘤细胞或肝细胞中是需要的，但转导了广泛细胞类型。当转导前体或干细胞时，表达的解除靶定也是重要的，但必须使转基因表达限制于分化细胞群的仅仅一种特定细胞系。目前，解决该问题的最多的努力依赖于靶定载体包膜或工程化组织特异性启动子。但是，这两种方法都存在限制。

靶定的包膜可以减少载体滴度，并且导致载体感染力降低(Sandrinet al.，2003)。基于但不等同于天然存在的启动子/增强子元件构建的组织特异性启动子与普遍表达的启动子相比通常在靶组织中弱表达。此外，这些组织特异性启动子不总是实现绝对的细胞特异性(Follenzi etal.，2002)。由于多种原因可以发生非靶细胞中的转基因表达，包括“渗漏的”启动子活性和启动子/增强子捕获(De Palma et al.，2005)。捕获现象是由于载体优先在活性转录位点整合而发生，这随后驱动不依赖于载体的启动子的转基因转录。

为了避开这些问题，并且制备可以维持高感染力和强表达的载体，而使转基因在特定细胞类型的表达受到紧密限制，我们开发了受到外源表达的微RNA(miRNA)调节的载体。

WO03/020931描述了展示miRNA的报道系统测定系统，提供了测量容易测定的基因的敲除的方法。该系统用于确定siRNAs和嵌合RNAs可以减少容易测定的荧光素酶基因的表达。

美国专利申请20050266552描述了报道构建体的构建，所述构建体适于导入哺乳动物细胞以建立可以用于鉴定参与miRNA翻译阻抑途径和/或所述途径的化学调节剂的细胞系。

Mansfield JH et al(2004)Nat Genet 36(10)：1079-83 Epub，erratumin Nat Genet(2004)36(11)：1238；和Brennecke J et al(2005)PloS Biol3(3)：e85描述了含有报道基因和miRNA靶序列的质粒。在两篇报道中，设计了构建体，用于监测内源miRNAs的表达，并且不是为了调节转基因和/或将表达限制在特定细胞类型的目的。

应该强调我们的发明的一个重要特征是我们描述了如何设计载体，以受到内源miRNAs调节，用于控制转基因表达，以实现载体的特定表达谱。尽管已经存在报道证明miRNA靶序列可以导入报道构建体(表达标记基因如荧光素酶的质粒)以对miRNA的表达进行示踪，它们没有描述特别利用miRNAs进行载体调节。它们特别没有描述利用本发明的载体进行基因治疗方法，以预防感兴趣的转基因的免疫介导的排斥，或增加表达毒性基因的病毒颗粒滴度的制造方法，所述毒性基因对产生病毒颗粒的细胞通常是有毒性的。

发明描述

根据本发明的一方面，提供了适用于基因工程方法的基因转移载体，所述基因工程方法例如基因治疗、基因转移和/或包含miRNA序列靶的转基因的表达的调节。miRNA“可操作性连接”于转基因。术语“可操作性连接”表示描述的成分处于允许它们以其预期方式起作用的关系。

在一种实施方案中，载体是包含miRNA序列靶的病毒载体颗粒。

在一种实施方案中，颗粒包含载体颗粒的基因组(DNA或RNA)，所述基因组包含miRNA序列靶。

在一种实施方案中，颗粒包含载体颗粒的基因组，所述RNA基因组包含miRNA序列靶。

在一种实施方案中，颗粒包含载体颗粒的RNA基因组，所述RNA基因组包含多个miRNA序列靶，它们可以是串联的。

在一种实施方案中，颗粒包含载体颗粒的RNA基因组，所述RNA基因组包含多个不同的miRNA序列靶，它们可以是串联的。