[发明专利]改进转谷氨酰胺酶的底物特异性

说明书

技术领域

本发明涉及源自于茂原链霉菌(Streptomyces mobaraense)的新型转谷氨酰胺酶变体。所述变体可以用于以提高的选择性改变肽。

背景技术

已知通过在蛋白质上结合能恰当改变肽的性质的基团可以改变肽的性质和特征。尤其是对于治疗用肽而言，可能希望甚至必要的是在所述肽上结合基团，这可以延长所述肽的半衰期。通常，这些结合基团是聚乙二醇(PEG)或脂肪酸-参见J.Biol.Chem.271，21969-21977(1996)。

转谷氨酰胺酶(TGase)先前已用于改变肽的性质。在食品工业，尤其是在乳制品工业中，许多技术可供使用例如采用TGase使肽交叉结合。其他文献公开了应用TGase改变生理活性肽的性质。EP 950665，EP 785276和Sato，Adv.Drug Delivery Rev.54，487-504(2002)公开了在TGase的存在下，含有至少一个Gln的肽和胺官能化PEG或者类似配体间的直接反应，Wada在Biotech.Lett.23，1367-1372(2001)中公开了β-乳球蛋白与脂肪酸通过TGase方法直接结合。国际专利申请WO2005070468公开了TGase可用于将官能团引入含有谷氨酰胺的肽从而形成官能化的肽，而该经过官能化的肽在随后的步骤中可与诸如能够与所述官能化的肽进行反应的PEG进行反应从而形成PEG化的肽。

转谷氨酰胺酶(E.C.2.3.2.13)也已知为蛋白质-谷氨酰胺-γ-谷氨酰转移酶，并催化以下一般反应

其中Q-C(O)-NH₂可表示含有谷氨酰胺的肽，而Q’-NH₂表示胺供体，在以上讨论的反应中提供将被引入到所述肽中的官能团。

体内常见的胺供体是与肽结合的赖氨酸，而上述反应则提供了肽的交叉结合。凝结因子因子XIII(Factor XIII)是在受伤时能实现血液凝结的转谷氨酰胺酶。不同的TGase相互之间也存在差别，例如，对作为底物的蛋白质的Gln周围的氨基酸残基的要求不同，即根据邻近所述Gln残基的是哪些氨基酸残基，不同的TGase将不同的含有谷氨酰胺的肽作为底物。该方面可在待修饰的肽含有多个Gln残基时得到利用。如果仅仅希望在存在的Gln残基中的一部分上选择性地结合肽，则通过选择仅仅接受相关Gln残基作为底物的TGase可实现该选择性。

人类生长激素(hGH)含有11个谷氨酰胺残基，因此任何TGase介导的hGH的结合都潜在地受到低选择性的妨碍。已发现在某些反应条件下，上述两步结合反应中，hGH在茂原链霉菌(S.mobaraense)TGase介导的反应中官能化，可以使hGH在两个位置被官能化，即40-Gln和141-Gln。因此需要鉴定能更特异性地介导hGH官能化的TGase的变体。

发明内容

本发明人已惊奇地发现在源自于茂原链霉菌(S.mobaraense)的TGase中取代某些氨基酸残基能提供更特异性地介导hGH官能化的TGase。

在一种实施方式中，本发明涉及源自于茂原链霉菌(S.mobaraense)的TGase(SEQ ID No.1)，其中至多三个酸性或碱性氨基酸残基已被其他碱性或酸性氨基酸残基所取代。

在一种实施方式中，本发明涉如在SEQ ID No.1中定义的肽，所述肽含有以下一个或多个取代：Tyr-75→酸性氨基酸残基；Tyr-302→碱性氨基酸残基；以及Asp-304→碱性氨基酸残基。

在一种实施方式中，本发明涉及编码本发明的肽的核酸构建体。

在一种实施方式中，本发明涉及含有编码本发明的肽的核酸的载体。

在一种实施方式中，本发明涉及含有载体的宿主，所述载体含有编码本发明的肽的核酸。

在一种实施方式中，本发明涉及含有本发明的肽的组合物。

在一种实施方式中，本发明涉及一种结合hGH的方法，所述方法包括使hGH与胺供体在本发明的肽的存在下进行反应。

附图说明

图1显示了hGH与1，3-二氨基-2-丙醇的TGase催化谷氨酰胺转移的典型CE分析图。

具体实施方式

在本说明书中，术语“酸性氨基酸残基”是指pKa低于7的天然氨基酸残基。具体实例包括Asp和Glu。