[发明专利]疫苗生产方法

说明书

本发明涉及进行碳二亚胺缩合反应的改进方法。具体地说，本发 明涉及使用碳二亚胺缩合进行的糖和蛋白的缀合。本发明还涉及含本 发明的糖-蛋白缀合物的可制备免疫原性组合物。

在免疫学中将细菌荚膜多糖广泛用于预防细菌疾病已有多年。但 是，此应用的问题在于免疫应答的T非依赖性特性。因此，这些抗原 在低龄儿童中的免疫原性差。此问题已通过将多糖抗原缀合至蛋白载 体(T辅助表位源)得以克服，然后可使用该载体激发T依赖性免疫应 答，甚至在生命的第一年中也可以。

本领域已知多种缀合技术。可通过如在US 4365170(Jennings)和 US 4673574(Anderson)中所记载的直接还原性胺化法制备缀合物。其 它方法描述于EP-0-161-188、EP-208375和EP-0-477508。或者，缀合 法可借助1-氰基-4-二甲氨基吡啶四氟硼酸盐(CDAP)对糖的羟基的 活化而生成氰酸酯。活化的糖由此可直接或经间隔(连接)基偶联至载 体蛋白上的氨基。例如，氰酸酯可与己二胺或己二酸二酰肼(ADH或 AH)偶联，并使用碳二亚胺(例如EDAC或EDC)化学法经蛋白载体上 的羧基将氨基衍生化的糖缀合至载体蛋白上。这类缀合物描述于PCT 公布申请WO 93/15760 Uninformed Services University以及WO 95/08348和WO 96/29094。另参见Chu C.等，Infect.Immunity，1983 245 256。

一般来说，蛋白载体上以下类型的化学基团可用于偶联/缀合：

A)羧基(例如经天冬氨酸或谷氨酸)，可使用碳二亚胺化学法将其 与糖部分上的天然或衍生化氨基缀合；

B)氨基(例如经赖氨酸)，可使用碳二亚胺化学法将其与糖部分上 的天然或衍生化羧基缀合；

C)巯基(例如经半胱氨酸)；

D)羟基(例如经酪氨酸)；

E)咪唑基(例如经组氨酸)；

F)胍基(例如经精氨酸)；和

G)吲哚基(例如经色氨酸)。

在糖上，一般来说以下基团可用于偶联：OH、COOH或NH₂。 醛基可在本领域已知的不同处理(例如：高碘酸盐、加酸水解、过氧化 氢等)之后产生。

直接偶联法：

糖-OH+CNBr或CDAP→氰酸酯+NH₂-蛋白质→缀合物

糖-醛+NH₂-蛋白质→席夫碱(Schiff base)+NaCNBH₃→缀合物

糖-COOH+NH₂-蛋白质+EDAC→缀合物

糖-NH₂+COOH-蛋白质+EDAC→缀合物

经间隔基(连接物)法直接偶联：

糖-OH+CNBr或CDAP→氰酸酯+NH₂----NH₂→糖----NH₂+ COOH-蛋白质+EDAC→缀合物

糖-OH+CNBr或CDAP→氰酸酯+NH₂----SH-糖----SH+SH-蛋 白质(具有暴露的半胱氨酸的天然蛋白或在例如通过SPDP修饰蛋白 的氨基后获得的天然蛋白)→糖-S-S-蛋白质

糖-OH+CNBr或CDAP→氰酸酯+NH₂----SH→糖----SH+马来 酰亚胺-蛋白质(氨基修饰)→缀合物

糖-COOH+EDAC+NH₂----NH₂→糖-NH₂+EDAC+COOH-蛋白 质→缀合物

糖-COOH+EDAC+NH₂----SH→糖-SH+SH-蛋白质(具有暴露的 半胱氨酸的天然蛋白或在例如通过SPDP修饰蛋白的氨基后获得的天 然蛋白)→糖-S-S-蛋白质

糖-COOH+EDAC+NH₂----SH→糖----SH+马来酰亚胺-蛋白质 (氨基修饰)→缀合物