[发明专利]核酸扩增的检测

说明书

本申请基于2005年7月15日提交的序列号60/699,950的美国临时专利申请和2005年12月9日提交的序列号60/749,003的美国临时专利申请，并根据美国法典第35编第119条要求它们的权益，由此它们各自通过引用并入本申请。

引言

核酸检测可通过多种测定形式进行。所述测定可为定性的，例如当用于评估生物样品时。然而，许多种生物应用可通过检测靶核酸的能力得以改进而不需要麻烦的印迹技术或光学方法通常所需的昂贵和精密的仪器。

附图简述

图1是根据本发明的一个实施方案描述与作为扩增子模板的多核苷酸序列杂交的示例扩增探针的示意图。

图2是描述切割来自杂交的核酸络合物的侧翼部分(flap moiety)的示意图。

图3是根据本发明的一个实施方案描述使用检测寡核苷酸检测聚合酶链式反应(PCR)的示意图。

图4是根据本发明的一个实施方案描述在扩增过程中能够自身引发其自身延伸的核酸序列的用途的示意图。

图5是根据本发明的一个实施方案描述包括含有标签序列的发夹环的核酸序列的示意图。

图6是根据本发明的一个实施方案描述在扩增过程中与检测寡核苷酸互补的可切割标签序列的用途的示意图。

图7是描述借助于切割的标签和电极表面的相互作用检测远距离切割位点的标签序列的示意图。

图8是根据本发明的一个实施方案的微流体系统的示意图。

图9显示了通过与对照反应比较进行的扩增子的电泳分析所证实的，标签序列的存在不影响靶序列的PCR扩增，如实施例1所述。

图10显示了标签序列的电化学检测，如实施例1所述。

图11显示了标签序列的电化学检测的另一个实例，如实施例2所述。

图12是描述在电极上经静电结合的氧化还原反应(redox)中心的标签检测的示意图，如实施例4所述。

图13是描述介导剂化合物的电化学反应的伏安图，如实施例7所述。

图14是化合物1和7的整合电荷(integrated charge)与DNA浓度的曲线图，如实施例7所述。

图15显示了化合物21的扩增探针的循环伏安图，如实施例10所述。

图16显示了化合物7的扩增探针的循环伏安图，如实施例10所述。

图17显示了标签序列1、2和3的切割和未切割的标签序列的检测之间的差异，如实施例11所述。

各实施方案的说明

该说明涉及用于检测靶多核苷酸序列的系统的方法。所述方法可包括在有效使探针形成探针-靶络合物的条件下使所述探针与包含至少一种靶多核苷酸序列的样品接触，其中所述探针自身包含靶互补片段和可检测标签。然后可从所述探针切割所述可检测标签，随后释放的标签与偶联至电极的标签互补物结合。由于固定化的标签：固定在电极上的标签互补物络合物而检测的电化学信号可与样品中靶多核苷酸序列的存在相关联。

在某些实施方案中，该说明包括一种用于检测核酸扩增的方法。在该方法中，参考图1，扩增探针10与作为用于多核苷酸扩增过程的扩增子模板或靶的多核苷酸序列12杂交。扩增探针10包括互补多核苷酸序列14和一个或多个检测标签16。在扩增过程中，酶作用切割互补序列的一个或多个检测标签。对切割的检测标签的检测又检测切割事件，并因此检测扩增子模板的复制，如图1所示。

本文所使用的“杂交”，是指两个多核苷酸序列通过两个序列的碱基间的氢键结合形成稳定的双链结构。即使两个序列非完全和严格互补，但其中一个序列可被认为“互补”于另一序列，条件是这两个序列包括足以使所产生的杂交物在标准实验室条件下稳定的互补区域。能够与扩增子模板至少大体上选择性杂交的任何互补序列是用于该方法目的的合适的互补序列。通常，所述互补序列由核苷酸和/或其类似物组成，具有足以赋予扩增探针至少一些结合特异性的长度。所述互补序列可包括RNA或DNA，或其混合物或杂交物。所述互补序列可包括天然核酸聚合物(生物来源)或合成的核酸聚合物(人工修饰或制备的)。