[发明专利]细胞迁移测定

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求2005年9月16日提交的申请号为60/718,057的美国临时专利申请，以及2006年5月17日提交的申请号为60/747,430的美国临时专利申请的优先权，上述申请披露的内容全部通过援引加入本文。

发明领域

本发明一般涉及血球渗出测定方法。更具体地讲，本发明涉及用于跨内皮迁移测定的组合物，以及制备和使用这些组合物的方法。

发明背景

细胞通过血管内皮的迁移是像炎症、动脉硬化和肿瘤转移这些状况的病理生理学上的重要事件。这些年已经发展出了体外测量细胞迁移的方法。最常用的方法是使用人工屏障(膜)，通常需要对迁移的细胞进行人工计数。市场上已有的细胞迁移测定装置有：经典Boyden小室(Boyden chamber)、细胞培养插入(cell culture insert)(改良版Boyden小室)、FluoroBlock^TM(BD Biosciences)和Cell MotilityHitKit^TM(Cellomics)。这些装置的主要局限性有通量低，细胞人工计数，使用为了细胞穿越的生物非相关材料，以及分析得到的结果存在困难。

最近，致力于模仿迁移细胞的体内环境的多层构建物已经提出(参见公布号为WO 2003/027256和WO 2004/046337的国际申请)。然而，该系统制备复杂，并且不适合高通量筛选。

仍需要改良的、使用简单的跨内皮细胞迁移(Transendothelial CellMigration，TEM)测定系统，尤其是用于药物探寻业的高通量筛选。

发明内容

本发明的目的是提供用于跨内皮细胞迁移测定的组合物和方法。这些组合物和方法特别适于高通量TEM测定，以及抑制或刺激TEM进程的介质的分析。

本发明的一方面提供用于检测细胞迁移的组合物，该组合物含有：含有胶原凝胶的固体层；接触所述固体层并含有第一细胞类型的第一细胞层；以及接种到所述第一细胞层上的第二细胞类型。固体胶原凝胶层任选地含有明胶。这方面的一个具体实施方式提供了在96孔板形式中的组合物，具有人类脐静脉内皮细胞(HUVEC)的汇合第一细胞层，中性粒细胞或者外周血单核细胞(PBMC)作为第二细胞类型。该实施方式的变化被提供在下面的详细说明和权利要求中。

本发明的另一方面提供了一种制备用于检测细胞迁移的物质组合物(composition of matter)的方法，该方法包括以下步骤：在容器内沉积和固化胶原凝胶以形成含有胶原凝胶的固体层；置第一类型细胞于所述固体层上并孵育所述第一细胞类型以形成同所述固体层接触的汇合细胞层；以及将第二细胞类型的细胞接种到所述第一细胞层上。提供了能够制备所述物质组合物的详细实施方式，包括在96孔板形式(96well plate format)内的所述复合物，其对于包括TEM在内的细胞迁移的高通量分析是理想的。在形成固体层前任选地将明胶溶液混入胶原凝胶中。

本发明的另一方面提供了一种检测包括TEM在内的细胞迁移的方法，包括以下步骤：孵育所述物质组合物；以及在所述组合物的所述固体层的第一位置检测迁移细胞。提供了该方法的一些实施方式，其采用96孔板形式中的组合物，适于利用自动化细胞分析仪进行自动化、高通量的细胞迁移分析。

本发明的又一方面提供了一种鉴别细胞迁移的介质(mediator)的方法，该方法包括：将细胞迁移的候选介质加入到所述的物质组合物中；孵育所述组合物；以及测定存在所述候选介质的情况下的细胞迁移，其中相对于缺少所述候选介质的组合物在应答上的差异鉴别了细胞迁移的介质。该方法的高通量实施为大量的细胞迁移/TEM介质的快速测定提供了一个平台，是制药业的重要技术(enabler)。

本发明的其它方面和优点将在下面的详细说明中体现出来。

附图简要说明

图1表示依照本发明实施方式的三维的跨内皮细胞迁移(TEM)测定的构建。在左侧是该系统侧视的示意说明。在右边表示了俯视的内皮细胞(EC)单层的图。

图2是表示胶原凝胶质量对中性粒细胞TEM的影响的图示。

图3是表示胶原凝胶质量对外周血单核细胞(PBMC)TEM的影响的图示。

图4表示胶原凝胶体积对中性粒细胞TEM的影响。

图5表示胶原凝胶体积对PBMC TEM的影响。

图6表示起始细胞密度对中性粒细胞TEM的影响。