[发明专利]包含由植物病毒外壳蛋白、肽接头和重组蛋白组成的多种融合蛋白的植物病毒颗粒及此类植物病毒颗粒用于蛋白质纯化的用途

说明书

发明领域

本发明涉及一种使用包含重组植物病毒颗粒或重组植物病毒样颗粒的亲和基质亲和纯化目的蛋白质的方法。本发明还涉及亲和基质和重组病毒颗粒，其中，重组病毒颗粒在其表面暴露一种或多种重组蛋白。本发明也涉及作为所述重组病毒颗粒的结构单元的融合蛋白、编码所述融合蛋白的多核苷酸、包含所述多核苷酸的植物、植物组织或植物细胞。本发明还涉及一种产生所述亲和基质的方法和产生所述重组病毒颗粒的方法。本发明也涉及所述融合蛋白用于亲和纯化目的蛋白质的用途。

发明背景

已知在产物产量已经优化的微生物蛋白质表达系统中，高达90％的总生产成本与自宿主纯化目的蛋白质有关，而不是产物本身的费用。为了使蛋白质生产更经济，需要允许快速和价廉的从其它污染组分中分离目的蛋白质或非蛋白质的目的小分子的策略。

(WO02/068927)已经提出使用具有与植物病毒颗粒表面连接的短肽(例如，FLAG-标签)的植物病毒颗粒通过亲和纯化用于纯化目的蛋白质。然而，在现有技术的方法中，待纯化的目的蛋白质必须融合至能将该肽结合至病毒颗粒表面的蛋白质如单链抗体或其它的纯化标签。因此必需在亲和纯化步骤后切割待纯化的蛋白质，这是人们想避免的额外的方法步骤。

抗体和抗体衍生物组成了大约20％的当前开发的生物药品。抗体的纯化占总生产成本的50-80％(综述：Roque等人，2004，Biotechnol.Prog.，20：639-654)。来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的A蛋白广泛用作免疫球蛋白纯化过程中的亲和蛋白质(综述：Jungbauer & Hahn，2004，Curr.Opin.Drug.Disc.& Dev.，7：248-256)。A蛋白主要通过疏水性相互作用(Dowd等人，1998，Nat.Biotechnol.，16：190-195)与免疫球蛋白的Fc结构域可逆地相互作用(Lindmark等人，1983，J.Immunol.Methods，62：1-13；Gouda等人，1998，Biochemistry，37：129-136)。A蛋白的高稳定性和选择性使其成为免疫球蛋白纯化的优选通用配体。用于市场的A蛋白的主要来源为大肠杆菌(E.coli)中产生的重组A蛋白(Duggleby & Jones，1983，NucleicAcids Res.，11：3065-3076；Engel等人，1992，Protein Expr.Purif.，3：108-113)。在通过用A蛋白亲和纯化来纯化抗体的现有技术方法中，首先必须表达并纯化A蛋白，然后与基质如琼脂糖凝胶连接，然后将其用于抗体的亲和纯化。因此，亲和基质的生产涉及许多步骤，并且是费力的和昂贵的。由于亲和基质的成本较高，亲和基质一般用于几次纯化步骤，导致在相同的亲和基质上纯化的连续的样品之间污染的危险。因此非常需要用于抗体纯化的更廉价和易于产生的亲和基质。此种廉价的亲和基质可以为单次使用的基质，避免污染的危险。

因此本发明的一个目的是提供一种亲和纯化目的蛋白质的方法，其中在亲和纯化步骤之后不需要在目的蛋白质上进行切割步骤。本发明的又一目的是提供一种使用经济的和易于获得的亲和基质纯化如治疗性抗体的免疫球蛋白或其融合蛋白的方法。本发明的另一目的是提供一种纯化治疗性抗体而没有污染人或其它动物病原体的危险的方法。本发明的再一目的是提供一种用于所述纯化方法的亲和基质。

发明总述

这些目的通过纯化目的蛋白质的方法实现，其包括如下步骤：

(a)提供包含融合蛋白的亲和基质，所述融合蛋白包含如下融合蛋白结构域：

(i)植物病毒外壳蛋白、

(ii)包含至少50个氨基酸残基的重组蛋白，和

(iii)任选至少一个连接所述植物病毒外壳蛋白和所述重组蛋白的肽接头，

所述融合蛋白的所述重组蛋白对待纯化目的蛋白质具有亲和性，

(b)使所述亲和基质与包含所述目的蛋白质的液体组合物在允许所述目的蛋白质结合至所述亲和基质的所述重组蛋白的条件下接触，其中所述亲和基质在所述条件下是不溶解的，