[发明专利]来自破囊壶菌属(Thraustochytrid)的△6去饱和酶及其用途

说明书

发明领域

本发明涉及从裂殖壶菌(Schizochytrium)分离的Δ-6去饱和酶基 因。本发明进一步涉及在酵母中克隆来源于裂殖壶菌的Δ-6去饱和酶。 揭示了Δ-6去饱和酶的核酸序列和氨基酸序列。进一步揭示了构建体、 包含与异源调节序列功能性组合的编码Δ-6去饱和酶这种酶的基因的 载体。所述新型Δ-6去饱和酶可用于将亚油酸转化为γ亚麻酸的代谢 途径(ω-6途径)。本发明提供来自裂殖壶菌的这些编码上述蛋白质的新 型核酸的鉴定、分离。本发明具体列举了带有包含该Δ-6去饱和酶基 因的载体的重组酵母细胞，其依靠所产生的酶将能够产生γ-亚麻酸。 可将使用该酶生产的多不饱和脂肪酸加入到药物组合物、营养组合 物、动物饲料以及其它制品例如化妆品中。

发明背景

Δ-6去饱和酶是合成高度不饱和脂肪酸例如花生四烯酸、二十二 碳六烯酸所需的关键酶。n-6途径的主要代谢产物是花生四烯酸 (20:4n-6)，而n-3途径的主要终产物是二十碳五烯酸(EPA)(20:5n-3)和 二十二碳六烯酸(DHA)(22:6n-3)。20碳和22碳(n-6)和(n-3)多烯脂肪酸 的可得性(availability)主要取决于Δ-6去饱和酶使18:2(n-6)和18:3(n-3) 去饱和的速率。Δ-6去饱和酶是微粒体酶，被认为是包括NADH-细胞 色素b5还原酶、细胞色素b5和Δ-6去饱和酶的三酶系统中的组分。 Δ-6去饱和酶催化PUFA合成的第一步、也是限速步骤。它对于通过 去饱和延长途径的脂肪酸流起闸门的作用。尽管其可作用于任何长链 脂肪酸，但底物结合亲合力随着业已存在的双键数目而大大增加。最 近鉴定的人缺乏Δ-6去饱和酶的病例强调了该途径的重要性 (Nakamura等，2003)。

不饱和脂肪酸例如亚油酸和α-亚油酸为不能由脊椎动物合成的 必需饮食成分，因为脊椎动物细胞能在脂肪酸的Δ-9位引入双键，但 不能在脂肪酸的Δ-9和甲基末端之间引入另外的双键。因此很显然， 动物不能在Δ-9位以外的地方去饱和，因此不能将油酸转化为亚油酸， 同样地，哺乳动物不能合成γ-亚麻酸。因为亚油酸和α-亚油酸为其它 产物的前体，所以它们是必需脂肪酸(不能由机体合成并因此需要构成 饮食的部分)，并且通常由植物来源获得。哺乳动物可将亚油酸转化为 γ-亚麻酸，后者可进而转化为花生四烯酸(20:4)，花生四烯酸是一种极 为重要的脂肪酸，因为其为大部分前列腺素的必需前体。此外，由亚 油酸、α-亚麻酸和油酸转化为高度多不饱和脂肪酸的动物生物转化， 主要由Δ6和Δ5去饱和酶经由饮食和激素刺激机制来调节。 (Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids 68(2)：151-62.)。

由于前述原因，对Δ-6去饱和酶这种酶、编码该酶的相应基因、 包括生产该酶的重组方法存在明确的需求。通过饮食摄入富含这样的 PUFA的植物来源，目前业已满足对这些必需脂肪酸的需求。但存在 不足之处，因为这些天然来源在可得性上总是遭遇无法控制的波动。 而且，植物油具高异质性组成，需要大量的纯化程序来分离特定的目 标多不饱和脂肪酸(US 20060035351)。然而，为满足日益增长的全球 人口的需求，不得不探索成本有效的替代物。

本发明涉及将编码分离自海洋生物裂殖壶菌的Δ-6去饱和酶的基 因导入到酵母，以生产脂肪酸，例如γ-亚麻酸、十八碳四烯酸和在 ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途径中由各自底物生物转化产生的其它脂肪 酸。酵母作为在合适的培养基中表达脂肪酸的良好系统，提供了大量 优势。很久以来酵母就被公认为蛋白质表达宿主，并用作蛋白质表达 宿主，因为其可提供加工系统连同方便使用的微生物系统。作为宿主， 其拥有许多优势，因为其既可用于生产分泌型蛋白，又可用于生产可 能需要翻译后修饰的胞质蛋白，其生物合成途径在很多方面象高等真 核细胞。而且，与其它真核系统相比，对其遗传学的了解要深入得多， 且其与大肠杆菌(E.coli)相似，易于操作。表达水平也在每升培养物几 个毫克的范围内。