[发明专利]制备美登木素生物碱抗体缀合物的方法

权利要求书

1.制备抗体-美登木素生物碱缀合物的方法，该方法包括下列步 骤：

(a)用双功能交联试剂接触抗体，以使连接体与所述抗体共价连 接，从而制备第一混合物，该第一混合物包含其上结合了连接体的 抗体，

(b)使所述第一混合物经受切向流过滤，从而制备纯化的其上结 合了连接体的抗体的第一混合物，

(c)通过在pH为4～9的溶液中使其上结合了连接体的抗体与 美登木素生物碱起反应，以制备第二混合物，该第二混合物包含(i) 通过所述连接体与美登木素生物碱化学偶联的抗体、(ii)游离的美登 木素生物碱和(iii)反应副产物，来使美登木素生物碱与纯化的第一混 合物中其上结合了连接体的抗体缀合，以及

(d)使第二混合物经受切向流过滤，以从第二混合物的其它成分 中纯化通过所述连接体与美登木素生物碱化学偶联的抗体，从而制 备纯化的通过所述连接体与美登木素生物碱化学偶联的抗体的第二 混合物。

2.权利要求1的方法，其中步骤(c)中的溶液的pH为4至6.0。

3.权利要求1的方法，其中步骤(c)中的溶液的pH为6.5至9。

4.权利要求1～3任何一项的方法，其中步骤(c)中的溶液包含 蔗糖。

5.权利要求1～3任何一项的方法，其中步骤(c)中的溶液进一 步包含缓冲剂，该缓冲剂选自柠檬酸盐缓冲剂、乙酸盐缓冲剂、琥 珀酸盐缓冲剂和磷酸盐缓冲剂。

6.权利要求1～3任何一项的方法，其中所述的抗体为单克隆抗 体。

7.权利要求6的方法，其中所述的单克隆抗体为人源化单克隆 抗体。

8.权利要求7的方法，其中所述的人源化单克隆抗体选自 huN901、huMy9-6、huB4、huC242、曲妥单抗、比伐单抗、西罗珠 单抗、CNTO95、huDS6和利妥昔单抗。

9.权利要求1～3任何一项的方法，其中所述的美登木素生物碱 包含硫醇基。

10.权利要求9的方法，其中所述的美登木素生物碱为N²′-脱乙 酰-N²′-(3-巯基-1-氧代丙基)-美登素。

11.权利要求9的方法，其中所述的美登木素生物碱为N²′-脱乙 酰-N²′-(4-甲基-4-巯基-1-氧代戊基)-美登素。

12.权利要求1～3任何一项的方法，其中所述的抗体经化学键 与所述的美登木素生物碱化学偶联，所述化学键选自二硫键、对酸 不稳定的键、对光不稳定的键、对肽酶不稳定的键、硫醚键和对酯 酶不稳定的键。

13.权利要求1～3任何一项的方法，其中所述的双功能交联试 剂选自4-(2-吡啶二硫基)丁酸N-琥珀酰亚氨基酯、4-(2-吡啶二硫基) 戊酸N-琥珀酰亚氨基酯和4-(马来酰亚氨基甲基)环己烷羧酸N-琥珀 酰亚氨基酯。

14.权利要求1～3任何一项的方法，其中所述的抗体是曲妥珠 单抗。

15.权利要求14的方法，其中所述的双功能交联试剂是4-(马 来酰亚氨基甲基)环己烷羧酸N-琥珀酰亚氨基酯。

16.权利要求14的方法，其中所述的美登木素生物碱为N²′-脱 乙酰-N²′-(3-巯基-1-氧代丙基)-美登素。