[发明专利]制备美登木素生物碱抗体缀合物的方法

说明书

技术领域

本发明涉及制备相当高纯度和稳定性的缀合物的方法，其 中所述缀合物包含与药物化学偶联的细胞结合剂。

发明技术

随着更有效地靶向并杀灭癌细胞的药物开发，癌症治疗取 得显著的进步。为了这个目的，研究人员利用癌细胞选择性表达的细 胞表面受体和抗原，来开发基于抗体的药物，所述抗体与肿瘤特异性 或肿瘤相关性抗原结合。在这点上，已将细胞毒性分子例如细菌和植 物毒素、放射性核素和某些化学治疗药物与单克隆抗体化学连接，所 述单克隆抗体与肿瘤特异性或肿瘤相关性抗原结合(参见，例如，国际 专利申请WO 00/02587、WO 02/060955和WO 02/092127，美国专利 5,475,092、6,340,701和6,171,586，美国专利申请公布号2003/0004210 A1，和Ghetie等，J.Immunol.Methods，112：267-277(1988))。通常将 这类化合物分别称为毒素、放射性核素和药物“缀合物”。常常也将它 们称作免疫缀合物、放射免疫缀合物和免疫毒素。在药物缀合物与肿 瘤细胞结合并释放药物或/和激活药物的细胞毒活性时，发生肿瘤细胞 杀灭。药物缀合物所提供的选择性使对正常细胞的毒性降到最低，因 此提高了药物在患者中的耐受性。

先前已经描述了将抗体与含巯基的细胞毒性剂例如美登 木素生物碱缀合的方法(参见，例如，美国专利5,208,020、5,416,064 和6,441,163)。例如，美国专利5,208,020和5,416,064公开了制备抗 体-美登木素生物碱缀合物的方法，其中首先用异双功能试剂(例如美 国专利4,149,003、4,563,304和美国专利申请公布号2004/0241174A1 中所述的)修饰抗体。美国专利5,208,020和5,416,064进一步描述了 经修饰的抗体与过量的含巯基的细胞毒性剂在pH 7的缀合，随后经 Sephadex^TM G25色谱柱纯化。也描述了用尺寸排阻色谱法(SEC)纯化 抗体-药物缀合物(参见，例如，Liu等，Proc.Natl.Acad.Sci (USA)，93： 8618-8623(1996)和Chari等，Cancer Research，52：127-131(1992))。

先前描述用于制备抗体-药物缀合物的方法是复杂的，因 为它们被用于执行或生产免疫缀合物的累赘步骤所阻碍，与最佳期望 的相比，所述免疫缀合物纯度更低或更不稳定。例如，在pH为6.0～ 6.5之间的缀合对于生产纯净和稳定的缀合物来说不是最佳的。此外， 在这些条件下的缀合反应通常是缓慢和无效率的，导致需要应用过度 的时间和材料。

改变或消除一个或多个制备步骤，而不损害产物质量例如 纯度和/或稳定性，将是理想的。进一步理想的是，具有除迄今为止所 述的那些之外的另外的纯化选择，因为一些使用细胞结合剂、连接体 和药物的某些组合的选择比使用其它的将更有效。

鉴于前文所述，在本领域中存在如下需求：开发改进的制 备具有相当高纯度和同时具有更大稳定性的细胞结合剂-药物缀合物 组合物的方法。本发明提供这样的方法。根据本文提供的本发明的说 明，本发明的这些和其它优点以及另外的发明特征将是明显的。

发明内容

发明简要概述

本发明提供一种制备相当高纯度和稳定性的缀合物的方 法，该缀合物包含与药物化学偶联的细胞结合剂。该方法包括(a)用双 功能交联试剂与细胞结合剂接触，以使连接体与细胞结合剂共价连接， 从而制备第一混合物，该混合物包含其上结合了连接体的细胞结合剂， (b)使第一混合物经受切向流过滤、吸附色谱法、吸附过滤、选择性沉 淀或它们的组合，从而制备纯化的其上结合了连接体的细胞结合剂的 第一混合物，(c)通过在pH为大约4至大约9的溶液中将其上结合了 连接体的细胞结合剂与药物起反应，以制备第二混合物，该混合物包 含(i)通过连接体与药物化学偶联的细胞结合剂、(ii)游离药物和(iii)反 应副产物，来使药物与纯化的第一混合物中其上结合了连接体的细胞 结合剂缀合，以及(d)使第二混合物经受切向流过滤、吸附色谱法、吸 附过滤、选择性沉淀或它们的组合，以从第二混合物的其它成分中纯 化通过连接体与药物化学偶联的细胞结合剂，从而制备纯化的第二混 合物。

发明详述