[发明专利]双功能锚定蛋白

说明书

本发明涉及免疫学和疫苗递送领域。更具体而言，涉及具有内在免疫 调节性质的细菌疫苗递送技术，其可以使任何目标抗原不经过预先的抗原 修饰而固定。

目前正在开发通过表达抗多种疾病的不同抗原决定簇的减毒细菌载体 株的疫苗递送或免疫。使用这种载体的粘膜(鼻或口)免疫已引起广泛关注。 例如，在口腔建群有在其表面表达所述抗原决定簇的基因工程人口腔共生 格氏链球菌(Streptococcus gordonii)的小鼠中检测到抗大黄蜂毒液的抗原 决定簇的系统和粘膜抗体应答(Medaglini等人，PNAS 1995，2；6868-6872)。

而且，通过口服递送其中破伤风毒素C片段在乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)组成型表达的重组细菌疫苗可以引起保护性免疫应答(Robinson等人， Nature Biotechnology 1997，15；653-657)。特别地，粘膜免疫，作为诱导针 对粘膜表面的特异性病原体的IgG和分泌性IgA的一种方法，被认为是接 种疫苗的有效途径。由细菌载体表达的免疫原以颗粒形式呈递到免疫系统 的抗原呈递细胞(例如M细胞)，因此其引起耐受性的可能性比可溶性抗原 低。另外，共同粘膜免疫系统的存在允许在一特定粘膜表面免疫，从而诱 导抗原特异性IgA的分泌，并在远端粘膜位点诱导其它特异性免疫应答。 这种方法的缺点在于菌株本身有可能引起炎症和疾病，可能引起发烧和菌 血症。另一种方法通过选择如乳杆菌(Lactobacillus ssp)和乳球菌 (Lactococcus ssp)的重组共生菌作为疫苗载体，避免了使用其本身会变为 致病菌的减毒菌株。

然而，使用这种重组生物的缺点在于它们可建群于粘膜表面，从而导 致长期暴露于这些重组微生物表达和释放的目标抗原。这种长期的暴露可 以引起免疫耐受性。此外，单单这种生物体体被遗传修饰并含有重组核酸 这样的事实，在整体上正面临公众(非专家的公众)的极大反对，这是由 于对含有重组DNA或RNA的产品的普遍接受性水平低。同样存在对使用 致病性菌株(即使是减毒的)的反对，或者反对使用来自致病菌株的蛋白质或 蛋白质的部分。如上所述，常规使用的蛋白异源表面展示技术通常需要使 用锚定或靶向蛋白，所述蛋白对有限的一系列一般为重组或致病性的微生 物具有特异性和选择性，因此极大限制了其潜在应用。我们先前在专利申 请WO 99/25836和WO 02/101026中已经提出了该问题，所述专利描述了 使用含有与抗原融合的AcmA(-样)结合域的嵌合融合蛋白，将抗原连接于 来自非重组革兰氏阳性菌的无活力球状肽聚糖颗粒。在与抗原结合前，革 兰氏阳性菌接受非酶预处理(参见WO 02/101026)。以前被称之为“外壳”的 肽聚糖颗粒仍然包含具有免疫调节性质的细菌成分，如肽聚糖。因此，这 些颗粒现在被称为革兰氏阳性增强基质(“GEM”)或“GEM颗粒”。

因此，WO 99/25836和WO 02/101026中公开的方法避免了使用那些通 常为重组的或具有致病性的活细菌和/或微生物。然而，以前公开的方法限 于可以作为嵌合蛋白产物制备(重组)的蛋白抗原的附着。对于一些蛋白抗原 这不是可行的方法。例如，制备所述抗原有特殊要求，抗原中存在AcmA(- 样)结合域的存在可起到干扰作用。另外，对于非蛋白抗原，当然不能进行 基因融合。而且，该方法不允许颗粒抗原的附着。可以设想通过化学方法 将目标抗原共价偶联到肽聚糖颗粒上，例如使用与抗原和细菌颗粒均能反 应的化学交联剂。乳酸菌细胞壁的肽聚糖层被多种物质，例如(脂)胞壁酸、 中性和酸性多糖和(表面)蛋白覆盖。因为化学修饰可以干扰抗原诱导的免疫 系统效力，所以这种化学方法不会适合于每种类型的抗原。此外，多数化 学交联剂需要特定的反应基(例如，SH)以调节共价相互作用，所述反应基 可能不总是存在，或者在交联分子中位于不合适的(例如，抗原结合)位点。

本发明的目的是克服这些限制。为此目的，开发了双功能多肽，其既 含有结合(非共价地)目标抗原的功能性，又含有结合(非共价地)免疫原性载 体(如GEM颗粒)的功能性。该系统可以使任何目标抗原不经过预先的修饰 而固定在GEM颗粒的表面。所述抗原可以是(多)肽、糖类、脂类、DNA、 RNA或任何其它生物有机化合物，甚至本身可以具有颗粒性质，例如病毒 颗粒。