[发明专利]生产具有增强的植物纤维降解酶的液体曲的方法，通过所述方法获得的液体曲及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生产具有增强的植物纤维降解酶如纤维素分解酶和木聚糖分解酶的活性的液体曲的方法，和通过所述方法获得的液体曲，及其应用。

背景技术

至于用于生产酒精饮料的日本酒曲，存在固体曲，将其培养以便将丝状真菌的孢子接种到已经用蒸煮等处理的原料中，以及存在液体曲，将其培养以便通过将原料及其它营养源加入到水中而制备液体培养基，然后将曲霉的孢子或预培养的曲霉的菌丝体等接种到所述液体培养基中。

在包括例如日本清酒、烧酒(shochu)、酱油、发酵的大豆酱、甜日本清酒等的发酵食品和饮料诸如酒精饮料的常规生产中，用固体培养方法制备的称为固体曲的物质已经得到广泛的应用。固体培养方法是将曲霉诸如白曲菌(Aspergillus kawachii)泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、酱油曲霉(Aspergillus sojae)等的孢子分散在固体原料诸如蒸汽-蒸煮的谷物上以允许曲霉在固体表面生长的培养方法。

例如，对于烧酒的生产，已经广泛地使用了固体曲诸如白曲菌和泡盛曲霉。然而，因为固体培养方法是原料和曲霉不均匀分散的培养体系，所以难以使诸如温度、含水量、和多种营养成分的因素均匀，并且固体培养方法在培养控制中是非常复杂的。另外，经常在开放条件下进行日本酒曲的生产，依据质量控制需要小心以便防止其它细菌的污染。因此，所述固体培养方法不适合于大规模生产。

相反，液体培养法容易培养控制和质量控制，所以它适于有效率的生产。然而，由于以下原因，例如，酶活性不足以酿造烧酒，所以由液体培养的曲霉获得的培养产品很少用作烧酒曲。

除上述原因之外，由液体培养法得到的培养产品不用于生产发酵食品和饮料诸如烧酒的主要原因是：已知在液体培养中曲霉产生酶诸如淀粉酶和纤维素酶的行为非常不同于在固体培养中的行为，并且还已知其生产能力总体上是低的(见非专利文献1和2)。

在酒精饮料诸如烧酒的生产中，醇通常由同时发生的糖化作用和发酵而产生。因此，来自曲霉的影响为曲霉提供葡萄糖的糖分解酶，特别是葡糖淀粉酶和酸稳定的α-淀粉酶，是酒精发酵中的关键酶。然而，众所周知葡糖淀粉酶的活性在由液体培养法得到的培养产品中是非常低的，并且其生产行为也非常不同于在固体培养中的生产行为(见非专利文献3至6)。

作为改善曲霉的葡糖淀粉酶活性的方法，报道了培养曲霉同时向菌丝体生长提供胁迫的方法(见专利文献1)以及将烘焙的谷类加入到曲霉培养液中的方法(见专利文献2)。专利文献1中公开的方法在多孔膜上或在具有气隙的内在固定试剂(inclusive immobilization agent)中进行培养，以允许编码葡糖淀粉酶的新基因glaB表达，因此增强酶活性。因此，所述方法要求严格的控制或特定的培养装置，因而它是不实用的。专利文献2中公开的方法利用烘焙谷类作为至少一部分原料在液体培养基中培养曲霉，所述方法需要烘焙谷类的额外的生产步骤。

本发明的发明人提供了涉及利用液体培养基培养曲霉的方法的发明，所述液体培养基含有曲霉几乎不分解的糖类(见专利文献3)。通过本发明液体培养的曲霉，可以方便地和廉价地获得具有高的糖分解酶诸如葡糖淀粉酶活性的曲霉培养产品，其可以用于生产发酵食品和饮料诸如日本清酒。

另一方面，最近，已经详细进行了关于酸-稳定的α-淀粉酶的分子生物学分析(见非专利文献7)。所述分析报道如下：白色曲霉具有分别负责两种不同性状即酸-不稳定的α-淀粉酶和酸稳定的α-淀粉酶的两种不同的淀粉酶基因。各自基因的表达行为相互非常不同。在液体培养中，酸不稳定的α-淀粉酶是充分产生的，而几乎不产生对于酿造烧酒是关键酶的酸稳定的α-淀粉酶。

对于生产烧酒，在低-pH环境下进行酿造，以防止烧酒醪液腐烂。由于它恰好在低pH条件下失活，所以酸不稳定的α-淀粉酶在烧酒酿造中很少有助于糖酵解。因此，对生产烧酒不可缺少的是，以高产率生产酸稳定的α-淀粉酶，所述酸稳定的α-淀粉酶被认为在通过液体培养曲霉的烧酒酿造中促进糖酵解。

已经详细地研究和报道了酸稳定的α-淀粉酶在液体培养的曲霉中的生产行为。然而，所述方法使用含有蛋白胨和柠檬酸盐缓冲溶液的合成培养基，并且需要100小时或更多的培养时间，所以将难以应用于实际的烧酒酿造(见非专利文献8至10)。