[发明专利]具有给予对三氟羧草醚的抗性的活性的原卟啉原氧化酶及其基因

说明书

技术领域

本发明涉及具有给予对三氟羧草醚(ACIFLUORFEN)的抗性的活性的原卟啉原氧化酶，尤其是蓝藻的原卟啉原氧化酶及其基因以及组入了该基因的转化体等。

背景技术

原卟啉原氧化酶是催化血红素和叶绿素合成的最终阶段反应，即从原卟啉原IX夺得6个电子合成原卟啉IX的反应的酶。血红素作为血红蛋白、细胞色素等血红素蛋白质的辅助因子，是对于呼吸、能量代谢、氧紧张的防御不可缺少的分子。血红素合成途径在微生物、植物、动物中共通存在，是以δ-氨基乙酰丙酸作为前体合成血红素的途径。而且，认为植物中的血红素和叶绿素，是以δ-氨基乙酰丙酸作为前体直至原卟啉IX的共通的途径来合成的，原卟啉原氧化酶担当着这两种合成途径的调节作用。陆生植物中承担叶绿素代谢系统的这种原卟啉原氧化酶成为了二苯醚(以下有时简称为DPE)系除草剂的目的酶。如果原卟啉原氧化酶的活性受到DPE系除草剂的抑制，作为该酶的底物的原卟啉原IX就渐渐积累于叶绿体中，最终原卟啉原IX漏到细胞质浆液中，于是过氧化酶对其进行氧化生成原卟啉IX。原卟啉IX如果与光和氧作用，原卟啉IX就可生成单线态氧以及其它反应性氧种类。脂质的过氧化以及必然伴随其的膜损伤的结果是植物细胞急速死亡(Lee et al，1993，Plant Physiol.，102，881)。另一方面，已经知道在蓝藻中即使在DPE系除草剂存在下，也可以生长，但是其原因和机制还完全不知道。

原卟啉原氧化酶基因已经在一些生物中获得了分离。例如，已知的有烟草的PPX1基因(Genbank登录号Y13465)、PPX2基因(Genbank登录号Y13466)、拟南芥的PPOX基因(Genbank登录号D83139)、枯草杆菌的HemY基因(Genbank登录号M97208)、小鼠的PPX基因(Genbank登录号D45185)、人的PPX基因(Genbank登录号D38537)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的PPX基因(Genbank登录号Z71381)、大肠杆菌的hemG基因(Genbank登录号X68660)等。

作为原卟啉原氧化酶的利用方法，例如，专利文献1公开了在植物体内使给予对DPE系除草剂的抵抗性的来源于枯草杆菌(Bacillus subtilis)的原卟啉原氧化酶表达的方法，以及表达该原卟啉原氧化酶的转基因植物。此外，例如专利文献2，公开了原卟啉原氧化酶基因，作为适于植物育种的卟啉生物合成系统的酶蛋白质的基因，其是从拟南芥(Arabidopsisthaliana)植物中获得的具有1.7kbp长度的基因，其特征在于，其自5’端起1.3kbp的部位存在限制性内切酶EcoRI识别碱基序列5’-GAATTC-3’。而且，例如专利文献3公开了一种用于评价大鼠或衣藻属(Chlamydomonas)来源的原卟啉原氧化酶活性抑制能力的简便方法，其特征在于，包括(1)在被验化合物存在或不存在下，在基本不含补充基于原卟啉原氧化酶活性的增殖能力的缺失的化合物的培养基中培养表达存在于DNA片段中的原卟啉原氧化酶基因的转化体，在各条件下测定该转化体的增殖度的工序，所述转化体是通过将可以在宿主细胞中起作用的启动子以可以发挥功能的形式与原卟啉原氧化酶基因结合而构成的DNA片段导入到基于原卟啉原氧化酶活性的增殖能力发生缺失的宿主细胞中而成的；(2)基于该增殖度的差异求出由于被验化合物的接触而造成的前述转化体的增殖抑制度，判断被验化合物对原卟啉原氧化酶活性的抑制能力的过程。

另一方面，在蓝藻中，根据其基因数据库的分析，曾推定大肠杆菌hemK类似基因为原卟啉原氧化酶，然而此后渐渐清楚蓝藻的该hemK类似基因不是原卟啉原氧化酶。但是，在蓝藻中还没有发现蓝藻的基因数据库中与目前所鉴定的其它生物种类的原卟啉原氧化酶同源的蛋白质，还没有分离出蓝藻的原卟啉原氧化酶(例如，参照非专利文献1)。

专利文献1：特愿平9-107833号公报

专利文献2：特开平9-140381号公报

专利文献3：特愿平11-346787号公报