[发明专利]使用亲脂离子作为介质添加剂，电处理细胞以改变这些细胞的膜通透性的方法

说明书

本发明涉及使用亲脂离子作为介质添加剂，用电场处理细胞以改变这些细胞的膜通透性的方法。特别地，本发明涉及使用亲脂离子作为介质添加剂的细胞电穿孔和电融合的方法。由于亲脂离子的这种加入，使效率且特别是再现性也显著提高，另外还使电穿孔和电融合方法相对较大的变异范围减小。

现有技术

在生物技术和生物医学的许多领域中，常规地使用细胞电转染和电融合来处理基因组和细胞溶胶。两种方法都基于使用高强度和很短持续时间的电场脉冲，其导致可逆的膜的电通透(所谓的电穿孔)。可通过电穿孔的方式将多种分子(包括激素、蛋白质、RNA和DNA)引入活细胞中。就介电电泳(dielectrophoretically)接触的细胞而言，在接触区中的膜通透导致细胞融合，其可用于产生杂交细胞(电融合)。

对于哺乳动物细胞的电穿孔/融合，通常使用几kV/cm的场强和几十μs(至ms)的脉冲持续时间。施加的电场导致膜的指数式充电，其可由诱导的跨膜电压V_g给出：

V_g(t)＝1.5aE₀cosθ(1-exp(-t/τ_m))    (1)，

其中a为细胞半径，θ为对外加场E₀的方向的极角，且τ_m为膜充电的时间常数。当V_g超过临界值V_c＝1V时发生膜通透。

通过下述方程计算膜充电的时间常数τ_m：

τm=aCm(1σi+12σe)---(2)]]>

其中C_m[μF/cm²]为表面特异性(surface-specific)膜电容且σ_i和σ_e为细胞溶胶和外部穿孔或融合介质的电导率[mS/cm]。

若在方程1中细胞半径使用7μm的一般值，则可能计算在面向电极的膜区域(θ＝0)中的通透的最小临界场强(条件是脉冲持续时间大大长于膜的驰豫时间t＞＞τ_m)：E_krit＝V_c/(1.5×a)≈1kV/cm。对于更大的细胞，根据方程1，需要小得多的场强。就哺乳动物细胞而言，时间常数τ_m处于0.1-1μs的范围(方程2：C_m＝1μF/cm²，σ_i≈5mS/cm，σ_e＝0.1-10mS/cm，见下文)。因此，使用的10-100μs的脉冲持续时间远长于τ_m，以致方程1可简化为：V_g＝1.5aE₀cosθ。

现有技术中已知通过在施加脉冲期间使用弱导电的、低渗的介质可显著提高电转染和电融合方法的效率[Zimmermann&Neil，1996；Sukhorukov等人，1998]。这样的介质包含各种糖类和糖衍生物作为主要的渗透剂。通常使用的一些糖包括单体的碳水化合物例如葡萄糖、山梨糖醇、肌醇或甘露醇，以及二糖，包括蔗糖或海藻糖[Zimmermann&Neil，1996]。

在电穿孔和电融合中降低渗透压和导电性发挥许多作用：

1)细胞的低渗膨胀促进膜通透，因为诱导的膜电压与细胞半径线性相关(见上文，方程1)。

2)由于细胞膜上的瞬时电变形力F_DEF，降低外部导电性大大改进电注射：