[发明专利]一种高纯度的人第Ⅸ凝血因子的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种高纯度的人第IX凝血因子的制备方法，特别涉及一种通过对包含第IX凝血因子的物质(取自人血浆或者重组的细胞培养基)进行离子交换层析和亲合层析来使病毒钝化或去除病毒的阶段，可制得几乎无掺杂蛋白质、比活性(specific activity)在150IU/mg以上的安全的高纯度第IX凝血因子。 

背景技术

人第IX凝血因子为凝血过程中不可缺少的的糖蛋白，在由于遗传因素或病理因素而血液中无第IX凝血因子或第IX凝血因子不足的情况下，会使血液中的凝血过程不完整，从而引发B型血友病。 

B型血友病主要通过遗传发生，在30,000～50,000名男婴中1名男婴具有B型血友病，属于罕见的遗传性疾病。为治疗这些B型血友病患者而采用了将纯化及浓缩后的人体血液中第IX因子提供给患者体的方法。 

在肝脏合成第IX因子时所需的维他命K，具有多种与其他维他命K-依赖性糖蛋白共同的特征。参与凝血过程的维他命K-依赖性糖蛋白有第II因子、第VII因子、第X因子等。第IX因子为含有约17.5％的糖(4.7％己糖、6.8％N-乙酰基氨基己糖、6％唾液酸)的单体结构(monomer)的糖蛋白，属于丝氨酸蛋白酶(serine protease)的一种。  分子量由第IX因子中的碳水化合物量所决定，其大小约为55,000～75,000Da。根据氨基酸序列所计算的单独的蛋白质分子量约为47,054Da。在分子结构内的N末端附近存在具有12个γ羧基谷氨酸(carboxyglutamic acid)的区域，在活化时需要磷脂(phospholipid)和钙离子。由于以每1分子第IX因子含有10分子左右含有属于酸性低聚糖(acidic oligosaccharide)的唾液酸(sialic acid)，因此具有很低的等电点(isoelectric point，pI)。根据第IX因子中存在的碳氢化合物的种类和量而表现出pl为4.0～4.6的多样性(Journal ofchromatography A，844，1999，119-128)。 

通过活化的第IXa因子(Factor IXa)水解第IX因子的氨基酸Arg(145)～Ala(146)之间和Arg(180)～Val(181)之间，由35个氨基酸构成的活性缩氨酸(activation peptide)脱离而活化，为与天然的第IX因子区别而将脱离活性缩氨酸的第IX因子称为第IX因子的活性型(active form)。并且也可通过包括活化的第VIIa因子(Factor VIIa)、组织因子(Factor III)及钙离子(Ca²⁺)的磷脂复合物所活化(如图1所示)。存于人血浆内的第IX因子的浓度为0.1μmol(5μg/ml)，从而具有较低的浓度。由此，为治疗B型血友病患者的治疗需要提供大量的全血或血浆，同时会过量提供存于血浆内的纤维蛋白原(fibrinogen)等的其他蛋白质。 

为减少这些副作用，1950年代末首次开发出浓缩的第IX因子。该方法是通过将血浆中的第IX因子吸附于硫酸钡(barium sulfate)而沉淀后通过洗涤去除其他蛋白质，此后分离出吸附于硫酸钡的第IX因  子。到后来，以无毒性盐类的三钙磷酸盐(tricalcium phosphate)代替了硫酸钡。这种通过吸附和沉淀的第IX因子的浓缩工序中再浓缩第IX因子的同时，会同时浓缩其他维他命K-依赖性糖蛋白中的第II因子、第VII因子、第X因子。这种浓缩物称为第IX因子复合物(Factor IXcomplex)。从1960年代开始，通过上述方式浓缩的第IX因子复合物普遍用于B型血友病的治疗。 

一般通过现有的述低温乙醇分馏工序中分离出血浆中的白蛋白或球蛋白，但是通过该低温乙醇分离工序不能分离第IX因子复合物，从而不适用于第IX因子的制备。为解决上述缺点，开发出利用阴离子交换层析的柱层析工序。即，通过冷沉(Cryoprecipitation)去除具有丰富的第VIII因子的冷凝蛋白质(cryoprecipitate)后，将去除冷凝蛋白质的、血浆中的第IX因子吸附于阴离子交换树脂纯化浓缩的方法。但是在该方法中也同样导致第II因子、第VII因子、第X因子的浓缩。这种利用阴离子交换树脂所生产的第IX因子复合物到现在也常用于B型血友病的治疗。