[发明专利]突变群体的高通量筛选

权利要求书

1.一种用于在诱变群体成员中检测目标序列中的突变的方法，包 括步骤：

(a)分离诱变群体每个成员的基因组DNA来提供每个群体成员的 DNA样品；

(b)集合步骤(a)中获得的DNA；

(c)用一对引物从DNA集合中扩增目标序列；

(d)集合步骤(c)的扩增产物来创建扩增产物库；

(e)使用高通量测序测定扩增产物或片段的核苷酸序列；

(f)通过聚类/联配片段的序列鉴定突变；

(g)对于目标序列的修改的功能筛选鉴定的突变；

(h)设计一个直接杂交到鉴定的突变上的引物；

(i)用步骤(h)的引物和步骤(c)的引物中的一个扩增步骤(b)的 库；

(k)鉴定携带突变的群体成员。

2.一种用于在诱变群体成员中检测目标序列中的突变的方法，包 括步骤：

(a)分离诱变群体每个成员的基因组DNA来提供每个群体成员的 DNA样品；

(b)集合步骤(a)中获得的DNA；

(c)用一对引物从DNA集合中扩增目标序列的部分，其中1个或 2个引物是加标签的；

(d)使用高通量测序测定扩增产物的核苷酸序列；

(e)通过聚类/联配片段的序列鉴定突变；

(f)鉴定具有突变的成员。

3.根据权利要求1或2的方法，其中的引物是被标记的。

4.根据权利要求1的方法，其中步骤(d)的文库中的扩增产物是 片段化的。

5.根据权利要求1的方法，通过从步骤(k)中的成员使用步骤(c) 的引物扩增目标序列来验证突变并测定扩增产物的序列。

6.根据权利要求1或2的方法，其中诱变群体通过用诱变化学试 剂、电离辐射、定向核酸变换或区域定向诱变中的一种或多种处理基 因组来获得。

7.根据权利要求1或2的方法，其中集合是一种3D-集合策略。

8.根据权利要求1或2的方法，其中高通量测序通过合成来进行。

9.根据权利要求8的方法，其中高通量顺序通过焦磷酸测序进 行。

10.根据权利要求1或2的方法，其中测序在一种固体支撑物上 进行。

11.根据权利要求1或2的方法，其中测序基于高通量测序。

12.根据权利要求8的方法，其中测序包括步骤：

(i)将测序接头连接到片段上；

(ii)将所述接头-连接片段退火到小珠上，每个小珠退火一个片 段；

(iii)在油中水微反应器中乳化小珠，使得每个微反应器含有一个 小珠；

(iv)进行乳化PCR来扩增小珠表面上的接头-连接片段(v)选择/ 富集连接有所述的扩增的接头-连接片段的小珠(vi)将小珠置于孔 中，使得每个孔包含一个小珠；和

(vii)产生焦磷酸信号。

13.根据权利要求1或2的方法，其中步骤(c)和/或步骤(i)中 的引物含有具有增强结合亲和性的核苷酸。

14.根据权利要求1或2的方法，其中在步骤(c)中扩增的目标序 列的部分为80到400bp。

15.根据权利要求14的方法，其中其中在步骤(c)中扩增的目标 序列的部分为90到300bp。

16.根据权利要求14的方法，其中其中在步骤(c)中扩增的目标 序列的部分为100到200bp。