[发明专利]突变群体的高通量筛选

说明书

发明背景

发明领域

在分子生物学和遗传学领域，本发明涉及用于鉴定群体中的突变 的、基于使用高通量测序技术的改进策略。发明进一步提供了能用于 该方法的试剂盒。

技术背景

在现代基因组研究中利用携带有诱导的或天然产生的突变的群 体，通过逆向遗传方法，来鉴定影响重要性状的基因。这尤其适用于 植物和具有农学重要性的农作物，并且对于其它有机体，例如酵母、 细菌等等，这种群体也是有用的。还可以使用其它有机体，例如动物、 鸟、哺乳动物等，但是这些群体明显难以获得或控制。然而可以观察 到，此处描述的发明属于非常一般的性质，因此也能用于这种有机体。

诱变群体是基因发现的辅助工具，因为这种群体经常被用于筛选 已知的功能缺失突变基因，或者评价因突变基因造成的有机体的表型 变化。分别鉴定携带有突变的感兴趣基因的有机体的限速步骤是筛选 工作。下面更加详细的描述了这个群体和筛选方法的原理，并且描述 了更有效的筛选方法，该方法增强了这些基因发现工具的价值。

一种被称为TILLING(基因组定向诱导局部损伤)的使用诱变群 体的技术(McCallum等人，Nat.Biotechnol 2000，18，455-457， McCallum et al，Plant Physiology，2000，123，439-442；Till等 人Genome Research 2003，13，524-530)，利用乙基甲磺酸(EMS)或 电离辐射(快中子轰击)(Li et al The Plant Journal，2001，27， 235-42)将随机诱导突变(多数为核苷酸取代)大量引入基因组。在群 体中每个植物都携带有数百(千)突变，其中一些因为某个或多个基 因或它们的调控序列的功能缺失(敲除或下调)而影响正常的发育、 形态或者产生某种表型。TILLING群体通常含有足够数量的植物来覆 盖所有的(每个基因5-20个)带有多个独立突变的基因。因此，在 TILLING中使用的诱变植物群体通常有3000-10,000个植物并能用于 两个方面：

逆向遗传学

“逆向遗传学”是使用TILLING群体的最常用方法。鉴定一个感 兴趣的基因，例如通过转录谱或候选基因法，随后要回答的问题是该 基因是否影响感兴趣的特定的表型特征。因此，面临的挑战是鉴定一 个(或数个)在该基因中存在功能缺失突变的植物。这通常通过多步 骤的筛选过程来完成，典型的包括如下步骤：

1.分离TILLING群体的大量(混合的)M2植物(例如，3072) 的基因组DNA。

2.制备等量DNA的集合(pool)，其中每个集合来自于8到32 个植物，集合水平依赖于CEL I筛选系统的敏感度(见下)。因此对 于3072个植物总共有96到384个DNA样品集合。

3.使用标记的PCR引物扩增所有DNA集合中的基因的多个部分。 使用重叠PCR片段来覆盖整个基因(例如，从1500bp基因中扩增出3 *600bp PCR片段)。

4.制备利用DNA样品集合获得的PCR产物的杂交双链，并和CEL I或其它识别并切割单核苷酸序列错配(例如绿豆核酸酶、S1核酸酶、 Surveyor等)的酶孵育，并在变性(测序)凝胶中或通过毛细管电泳 解析处理的样品。

5.通过观测CEL I处理所得消化产物的条带来对携带有突变基因 的植物所组成的集合进行鉴别。

为了鉴定携带突变的植物，对阳性集合中的植物的个别DNA重复 进行PCR，随后进行双向Sanger测序。

培养包含突变的植物并和野生型进行异型杂交(out-cross)来确 立突变和观测到的表型变化之间的因果关系。

CEL I筛选的优点(上述步骤3-5)是，和用Sanger测序分别测 序所有植物相比预先筛选集合的样品降低了花费。

但是，CEL I筛选的一个局限是并非所有鉴定出的突变都影响基 因功能(例如，沉默置换)，并且这种情况只有在阳性集合中的植物 个体的PCR产物被测序之后才能知道。然而，和分别对所有植物的PCR 产物测序相比，CEL I介导的筛选方法是节约成本的。