[发明专利]具有新切割特异性的I－CreI归巢核酸内切酶变体及其用途

权利要求书

1.一种改造出具有经修饰的切割特异性的I-CreI归巢核酸内切酶变体 的方法，所述方法包括至少以下步骤：

(a)用选自A、C、D、E、G、H、K、N、P、Q、R、S、T、L、V、 W和Y的氨基酸替换I-CreI中β₁β₂发夹的K28、Y33和/或S40中至少 一个氨基酸，

(b)选择和/或筛选来自步骤(a)的能够切割DNA靶序列的I-CreI变体， 所述靶序列由突变的I-CreI位点组成，其中至少-9位的a核苷酸和/或 +9位的t核苷酸被不同的核苷酸所替换。

2.一种改造出具有经修饰的切割特异性的I-CreI归巢核酸内切酶变体 的方法，所述方法包括至少以下步骤：

(a)用选自A、C、D、E、G、H、K、N、P、Q、R、S、T、L、V、 W和Y的氨基酸替换I-CreI中β₁β₂发夹的K28、N30、Y33、Q38和/或 S40中至少一个氨基酸，

(b)选择和/或筛选来自步骤(a)的能够切割DNA靶序列的I-CreI变体， 所述靶序列由突变的I-CreI位点组成，其中至少-8位的a核苷酸和/或 +8位的t核苷酸被不同的核苷酸所替换。

3.根据权利要求1或2的方法，其中步骤b)中的DNA靶标衍生自选 自SEQ ID NO：1至3的I-CreI位点。

4.根据权利要求1或2的方法，其中步骤b)中的DNA靶标包含具有 下式的序列：c_-11n_-10n_-9n_-8m_-7y_-6n_-5n_-4n_-3k_-2y_-1r₊₁m₊₂n₊₃n₊₄n₊₅r₊₆k₊₇n₊₈n₊₉n₊₁₀g₊₁₁，其中n是 a、t、c或g，m是a或c，y是c或t，k是g或t，r是a或g只要当n_-9n_-8是aa时，n₊₈n₊₉不是tt，并且当n₊₈n₊₉是tt时，n_-9n_-8不是aa即可。

5.根据权利要求4的方法，其中n_-5n_-4n_-3是gtc和/或n₊₃n₊₄n₊₅是gac。

6.根据权利要求1或2的方法，其中步骤b)中所述DNA靶标的-11到-8 位和+8到+11位的核苷酸序列和/或-5到-3位和/或+3到+5位的核苷酸序列 是回文的。

7.根据权利要求1或2的方法，其中步骤b)中的DNA靶标包含-9到-8 位的核苷酸二联体和/或+8到+9位的核苷酸二联体，所述-9到-8位的核苷 酸二联体选自：ag，at，ac，ga，gg，gt，gc，ta，tg，tt，cg，ct或cc，所述+8到+9 位的核苷酸二联体是-9到-8位所述核苷酸二联体的反向互补序列。

8.根据权利要求1或2的方法，其中步骤b)中的DNA靶标还包括用不 同核苷酸替换I-CreI位点-10位的核苷酸a和/或+10位的核苷酸t。