[发明专利]具有新切割特异性的I－CreI归巢核酸内切酶变体及其用途

说明书

本发明涉及一种改造出能够切割突变I-CreI位点的I-CreI归巢核酸 内切酶变体的方法，所述突变I-CreI位点在±8到±10位有改变。本发明 还涉及可得自所述方法的I-CreI归巢核酸内切酶变体、编码所述变体的 载体、经所述载体修饰的细胞、动物或植物，并涉及所述I-CreI核酸内 切酶变体及其衍生产物在遗传工程、基因组治疗和抗病毒治疗中的用 途。

大范围核酸酶是具有大(＞14bp)切割位点的序列特异性核酸内切 酶，其可引发活细胞中特定基因座的DNA双链断裂(double-strand break，DSB)(Thierry和Dujon，Nucleic Acids Res.，1992，20， 5625-5631)。大范围核酸酶已用于在培养的细胞和植物中刺激其靶序列 周围发生同源重组(Rouet等，Mol.Cell.Biol.，1994，14，8096-106； Choulika等，Mol.Cell.Biol.，1995，15，1968-73；Donoho等，Mol.Cell. Biol，1998，18，4070-8；Elliott等，Mol.Cell.Biol.，1998，18，93-101；Sargent 等，Mol.Cell.Biol.，1997，17，267-77；Puchta等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 1996，93，5055-60；Chiurazzi等，Plant Cell，1996，8，2057-2066)，这使得大 范围核酸酶诱导的重组成为用于基因组工程的有效且有力的方法。大范 围核酸酶诱导重组的应用长期以来受到天然大范围核酸酶种类的限制， 当前技术的主要限制在于需要预先在目的基因座引入大范围核酸酶切 割位点。

因此，人们对产生具有特定底物特异性的人工大范围核酸酶进行了 深入地研究。这样的蛋白质可用于切割真正的染色体序列，并开启了基 因组工程在多种应用中的新前景。例如，大范围核酸酶可用于诱导修正 与单基因遗传病相关的突变，避免目前基因治疗方法中使用的随机插入 转基因所导致的风险(Hacein-Bey-Abina等，Science，2003，302，415-419)。

最近，Cys2-His2型锌指蛋白(ZFP)的锌指DNA结合结构域可与 FokI核酸内切酶的催化结构域融合，从而诱导多种类型细胞(包括人 淋巴样细胞)中的重组(Smith等，Nucleic Acids Res，1999，27，674-81； Pabo等，Annu.Rev.Biochem，2001，70，313-40；Porteus和Baltimore， Science，2003，300，763；Urnov等，Nature，2005，435，646-651；Bibikova等， Science，2003，300，764)。ZFP的结合特异性相对容易操作，目前得到了 一组能够结合许多(g/a)nn(g/a)nn(g/a)nn序列的新的人工ZFP(Pabo等， 如前引用；Segal和Barbas，Curr.Opin.Biotechnol.，2001，12，632-7； Isalan等，Nat.Biotechnol.，2001，19，656-60)。但是，保持非常窄的底物 特异性是基因组工程应用的主要问题之一，目前尚不清楚ZFP是否满 足治疗应用极其严格的要求。另外，已证明这些融合蛋白质在细胞中具 有高毒性(Porteus和Baltimore，如前引用；Bibikova等，Genetics，2002， 161，1169-1175)，这可能是由于特异性水平低所致。

在自然界中，大范围核酸酶基本上以归巢核酸内切酶(homing endonuclease，HE)为代表，归巢核酸内切酶是由可移动遗传元件 (mobile genetic element)编码的核酸内切酶家族，其功能是在被称为 “归巢”的过程中起始由DNA双链断裂(DSB)诱导的重组事件 (Chevalier和Stoddard，Nucleic Acids Res.，2001，29，3757-74； Kostriken等，Cell；1983，35，167-74；Jacquier和Dujon，Cell，1985，41， 383-94)。在细菌、真核生物和古细菌中已鉴定出数百种HE(Chevalier 和Stoddard，如前引用)；但是在所选基因中找到HE切割位点的可能 性是非常低的。