[发明专利]在两个功能性亚结构域中具有突变的LAGLIDADG归巢核酸内切酶变体及其用途

权利要求书

1.通过突变核心结构域的两个功能性亚结构域，改造亲本I-CreI  LAGLIDADG归巢核酸内切酶得到I-CreI LAGLIDADG归巢核酸内切酶 变体的方法，其至少包括以下步骤：

(a)构建第一变体，其在所述核心结构域的第一功能性亚结构域中具有突 变，所述第一功能性亚结构域与所述亲本I-CreI LAGLIDADG归巢核酸内 切酶切割位点的一半的第一部分相互作用，所述构建通过以下步骤实现：

(a₁)用不同的氨基酸替换位于I-CreI中26至40位的第一亚结构域的28、 30、33、38和/或40位的至少一个氨基酸，其中所述被替换的氨基酸与亲 本I-CreI LAGLIDADG归巢核酸内切酶半位点的所述第一部分相互作用，

(a₂)通过用不同的核苷酸替换所述半位点第一部分的至少一个核苷酸来 选择和/或筛选步骤(a₁)的第一变体，其能够切割来源于所述亲本I-CreI  LAGLIDADG归巢核酸内切酶半位点的第一DNA靶序列，

(b)构建第二变体，其在所述核心结构域的第二功能性亚结构域中具有 突变，所述第二功能性亚结构域与所述亲本I-CreI LAGLIDADG归巢核酸 内切酶半位点的第二部分相互作用，所述构建通过以下步骤实现：

(b₁)用不同的氨基酸替换位于I-CreI中44至77位的第二亚结构域的44、 68、70、75和/或77位的至少一个氨基酸，所述第二亚结构域对应位于I-CreI 中44至77位的亚结构域，其中所述被替换的氨基酸与亲本I-CreI  LAGLIDADG归巢核酸内切酶半位点的所述第二部分相互作用，

(b₂)通过用不同的核苷酸替换所述半位点第二部分的至少一个核苷酸来 选择和/或筛选步骤(b₁)的第二变体，其能够切割来源于所述亲本I-CreI  LAGLIDADG归巢核酸内切酶半位点的第二DNA靶序列，

(c)构建第三变体，其在所述亲本I-CreI LAGLIDADG归巢核酸内切酶 的所述第一和第二功能性亚结构域中具有突变，所述构建通过以下步骤实 现：

(c₁)将步骤(a₂)和步骤(b₂)的两个变体的突变组合在一个变体中，以 及

(c₂)选择和/或筛选能切割嵌合DNA靶序列的步骤(c₁)的变体，所述嵌 合DNA靶序列包含所述第一变体DNA靶标半位点的第一部分和所述第二 变体DNA靶标半位点的第二部分，并且所述嵌合DNA靶序列具有式(I)： c_-11n_-10n_-9n_-8m_-7y_-6n_-5n_-4n_-3k_-2y_-1r₊₁m₊₂n₊₃n₊₄n₊₅r₊₆k₊₇n₊₈n₊₉n₊₁₀g₊₁₁(SEQ ID NO：2)， 其中n是a、t、c或g，m是a或c，y是c或t，k是g或t，r是a或g， 条件是当n_-10n_-9n_-8是aaa以及n_-5n_-4n_-3是gtc时，则n₊₈n₊₉n₊₁₀不是ttt并且 n₊₃n₊₄n₊₅不是gac，当n₊₈n₊₉n₊₁₀是ttt以及n₊₃n₊₄n₊₅是gac时，则n_-10n_-9n_-8不是aaa并且n_-5n_-4n_-3不是gtc。